分泌蛋白参与机体免疫、凝血与抗凝血、物质运输、营养、细胞或组织之间通讯以及生长信号调节等多种重要的生理过程，是新的治疗方法和药物靶点的丰富资源。血浆蛋白质绝大部分由细胞或组织合成，经过信号肽剪切、糖基化、磷酸化等翻译后修饰加工之后分泌到血浆中，因此从某种意义上来讲，血浆蛋白质组涵盖了分泌蛋白质组的内容。这里我们应用多维色谱和串联质谱联用技术分析了肝细胞分泌蛋白质组，并且用可剪切型同位素标记的亲和标签技术(Cleavable Isotope-Coded Affinity Tags，cICAT)分析了AFP阳性肝癌细胞株HepG2和AFP阴性正常肝细胞株Chang liver分泌蛋白质组之间的差异。我们总共鉴定了1778种人类蛋白质，并成功地发现81种蛋白质在它们之间存在着2倍以上的差异变化，其中31种蛋白质在肝癌细胞HepG2分泌物中表达量增高。我们对这31个蛋白质进行文献查询验证，发现12个蛋白质在以往的文献报道中同样在肝细胞癌(HCC)中表达量增高，例如AFP,载脂蛋白E和玻连蛋白等；8个蛋白质在以往的文献报道中在其它癌症中表达量增高，例如补体C3和锌α2糖蛋白等；仅1个蛋白质在以往的文献报道中在其它癌症中低表达。这些不仅说明了从癌症分泌蛋白质组中寻找肿瘤标志物策略的优越性，同时也说明了通过cICAT技术比较分析肿瘤分泌蛋白质组来寻找癌症标志物的结果的可靠性和正确性。 随后，我们用细胞培养中稳定同位素标记氨基酸的方法(Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture，SILAC)结合优化的非标记定量技术(Label-free Quantitative Technique，LFQ)分析了肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L02分泌物之间的差异。以传统的2倍差异为阈值，我们用LFQ分析3对不同实验中得到的同一组分(1:1)时，发现假阳性率为2.9％±0.7％。LFQ在两次重复的实验中定量得到的蛋白质以及得到的蛋白质的相对定量比值之间的重复性都相当高。在两次重复的实验中有83％的蛋白质被共同定量到，并且这些蛋白质的相对定量比值之间具有很强的相关性(PEARSON相关系数等于0.97)，两次实验得到的蛋白质相对定量比值之间的相对比率为1.02±0.45。与SILAC方法相比较，LFQ具有相同或者稍好的重复性。当蛋白质在相对定量双方的丰度均较大时，LFQ能够分析小于2倍的表达变化差异，具有更高的灵敏度。另外，SILAC方法和LFQ技术共同定量到的蛋白质的相对定量比值，它们之间也具有很强的相关性(PEARSON相关系数等于0.92)，说明非标记定量技术得到的蛋白质相对定量比值同样具有良好的可靠性。总而言之，非标记定量方法并不亚于其它蛋白质组定量方法如cICAT和SILAC，能够精确和高通量地分析肝癌细胞分泌蛋白质组，从中找到有价值的诊断和预后的血清学标志物。我们结合SILAC和LFQ方法总共得到了299个蛋白质在HepG2和LO2分泌蛋白质组中存在着两倍以上的表达差异。其中121个差异表达蛋白质的定量信息(≥2倍)至少在三次差异定量分析中得到验证。结合前面从HepG2和Chang差异分泌蛋白质组中得到的数据结果，我们通过免疫印迹和酶联免疫吸附实验验证了载脂蛋白E、α1酸性糖蛋白1／2、AFP、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-7、TIMP-1和TIMP-2这几个表达差异蛋白质在肝癌患者血清和正常人血清之间的表达变化，有待成为有应用价值的肝标志物。 另外，我们用固相pH梯度等电聚焦蛋白质预分级和串联质谱联用技术分析了人类血浆的蛋白质组成和特性。随后，我们以HepG2和LO2同位素标签的分泌物为中介分析了肝癌血浆和正常人血浆之间的蛋白质表达差异，成功地得到300个血浆蛋白的定量信息。其中86种蛋白质在肝癌患者血浆中表达量增高如AFP和载脂蛋白A-I等，60种蛋白质在肝癌患者血浆中表达量降低如E1泛素激活酶和FK506结合蛋白4等。这些结果说明用同位素标签分泌蛋白质组做中介分析肝癌患者血浆跟正常人血浆之间的差异具有一定的可行性。 随着蛋白质组学技术的迅速发展和不断完善，利用这些技术和手段来研究细胞或组织的分泌蛋白质纽包括血浆蛋白质组，可以从中了解疾病的发生发展、个体的发育调控以及寻找疾病的标志物和新的治疗靶点等。总而言之，分泌蛋白质组已经逐渐成为功能蛋向质组学的一个重要组成部分，而癌症分泌蛋白质组的研究将给肿瘤患者带来新的希望。