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目的:肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺鳞癌占肺癌总数的40%左右,因此肺鳞癌的发病机制及治疗的研究,其重要性已经不言而喻。肿瘤的发生不仅与肿瘤细胞的生长失控导致增殖过度有关,也与肿瘤细胞的凋亡受到抑制,不能使机体内异常的细胞死亡从而清除不需要细胞有关。目前肿瘤的临床治疗,比如放疗、化疗等都是主要通过诱导肿瘤细胞的凋亡来发挥作用。因此研究细胞凋亡在肿瘤治疗中的重要性也越来越受重视。蛋白质是人类一切生命活动的主要承担者,蛋白质组学的研究能够帮助我们比较肿瘤细胞及其正常细胞中蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异,从而发现与肿瘤相关的差异蛋白,这些肿瘤相关的差异蛋白不仅可为研究肿瘤发病机理提供线索,而且可作为肿瘤诊断和治疗的生物标志物。膜联蛋白A5（Anxa5）是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白家族中的一员,其功能多样,参与抗凝血、抗炎症、凋亡等多方面。近年来的研究发现,Anxa5的异常表达与多种恶性肿瘤密切相关。在前期的工作中,我们以临床标本人肺鳞癌及其癌旁组织为研究对象,运用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）对2D-DIGE（双向电泳）电泳图谱进行分析,筛选并鉴定出了81种与肺鳞癌发生发展相关的蛋白,Anxa5是其中下调的蛋白。我们建立了高表达Anxa5的NCI-H520稳转细胞株:pcDNA3.1-NCI-H520-ANXA5。应用二甲基稳定同位素标记结合质谱分析法寻找两者之间的差异表达蛋白并进行验证。本研究旨在通过肺鳞癌的蛋白质组学研究,进行大规模、高通量的蛋白质分离、鉴定以及生物信息学分析,对比不同状态下蛋白质表达水平的变化,从而找到有价值的差异蛋白开展深入研究。方法:一、检测Anxa5高表达对顺铂诱导的细胞凋亡的影响。1.质粒转染,获得肺鳞癌空载细胞株pcDNA3.1-NCI-H520-NC,稳转细胞株pcDNA3.1-NCI-H520-ANXA5-1,pcDNA3.1-NCI-H520-ANXA5-2。2.利用电子显微镜检测凋亡细胞的形态;DAPI染色、Hoechst 33342/PI双染、TUNEL、流式细胞仪等实验方法检测Anxa5高表达对顺铂诱导的细胞凋亡的影响。二、应用二甲基稳定同位素标记技术,结合质谱分析,对肺鳞癌细胞株NCI-H520和稳转细胞株pcDNA3.1-NCI-H520-ANXA5-1的蛋白表达进行研究,寻找出其中的差异表达蛋白。三、生物信息学分析1.应用DAVID（the database for annotation,visualization and integrated discovery）以及IPA（ingenuity pathways analysis）对差异蛋白全面进行生物信息学分析。2.应用Western blot方法检测了其中八种差异蛋白PDIA6、HSPA5、JUP、KRT6A、FN1、EN01、ALDOA、HSP90在肺鳞癌细胞株中的表达。结果:1.电子显微镜检测发现凋亡细胞的染色质固缩并凝结成块,聚集在核膜周边,呈新月状或环状小体;细胞质浓缩,内质网变疏松,线粒体肿胀,形成空泡。细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。2.DAPI染色、Hoechst 33342/PI双染、TUNEL、流式细胞仪结果经统计学分析,NCI-H520,pcDNA3.1-NCI-H520-NC 与pcDNA3.1-NCI-H520-ANXA5-1,pcDNA3.1-NCI-H520-ANXA5-2之间的凋亡率有显著差异（P<0.05）,pcDNA3.1-NCI-H520-ANXA5细胞的凋亡率均高于空转细胞及未转细胞。3.NanoLC-MS/MS分析及数据处理,将所得质谱数据用MASCOT（版本2.3.02）及Mascot Distiller针对IPI human正反合库数据库（V.201110）进行搜索。肽段以胰酶完全酶解条件搜库（最多容许两个漏切位点）。允许的母离子质量偏差为10 ppm,碎片离子质量偏差为0.5 Da。搜库时半胱氨酸残基加烷基化固定修饰;可变修饰分别为:蛋氨酸残基加氧化修饰,在要求蛋白鉴定p<0.05且至少含有一个bold red肽段的前提下,将Ion score大于20的肽段用于定量,控制FDR<1%。获得稳转细胞株pcDNA3.1-NCI-H520-ANXA5和NCI-H520之间的差异表达蛋白质49个,其中上调蛋白27个,下调蛋白22个。4.经生物信息学分析,这些蛋白主要参与代谢过程,生物合成及DNA复制等方面。细胞组分分布则主要存在于膜内,细胞器,其次于核内,细胞质中。鉴定出的差异蛋白主要行使6种生物学功能,包括结构分子活性蛋白,细胞骨架结构成分,分子内氧化还原酶活性,醛糖和酮糖相互转化,参与肌动蛋白结合和参与蛋白复合物结合。差异蛋白主要富集于15种信号通路,但主要参与了①糖代谢通路;②蛋白质翻译后处理相关通路;③细胞骨架活动通路;④DNA损伤修复通路等。5.Western blot检测相关通路蛋白PDIA6,HSPA5,JUP,KRT6A,FN1,ENO1,ALDOA,HSP90,结果显示稳转细胞株pcDNA3.1-NCI-H520-ANXA5中PDIA6,HSPA5,JUP,KRT6A,HSP90呈低表达,而FN1,ENO1,ALDOA呈高表达;与质谱结果一致。结论:1.Anxa5高表达能够促进顺铂诱导的肺鳞癌细胞株NCI-H520细胞的凋亡。2.筛选出了在Anxa5质粒稳转细胞株pcDNA3.1-NCI-H520-ANXA5和野生型NCI-H520细胞株中差异表达的蛋白49个,其中上调蛋白27个,下调蛋白22个。差异蛋白主要参与了糖代谢,蛋白质翻译后处理,细胞骨架活动及DNA损伤修复等细胞信号通路活动。3.Western Blot检测PDIA6、HSPA5、JUP、KRT6A、FN1、ENO1、ALDOA、HSP90在肺鳞癌细胞株中的表达与质谱结果一致,质谱结果可靠,可依此开展深入研究。