水资源短缺是制约我国干旱、半干旱地区苹果产业发展的重要因子。实现有限水资源的高效利用,提高植物水分利用效率(Water use efficiency,WUE),是实现节水农业和农业可持续发展的重要战略措施。本研究以WUE差异显著的苹果品种资源为材料,利用iTRAQ蛋白组学技术,结合生理指标分析,研究了调控苹果WUE的主要生物学途径及关键基因,并对所发现的基因进行了功能鉴定。1.以干旱下WUE存在差异的两个苹果(Malus domestica Borkh.)品种‘秦冠’和‘长富-2’为材料,进行长期干旱处理后的研究结果表明,与正常供水植株相比,长期干旱处理提高了‘秦冠’叶片水平上的水分利用效率(WUEi),但‘长富-2’的没有得到提高。同时发现干旱下‘秦冠’的WUEi大于‘长富-2’,主要是由于其较高的净光合速率引起的。为研究‘秦冠’苹果干旱下高WUE的调控机制,利用iTRAQ技术对正常供水和长期干旱处理的‘秦冠’和‘长富-2’苹果叶片进行了比较蛋白组学分析,结合生理特性调查,研究了‘秦冠’苹果干旱下高WUE的主要调控途径和关键基因,为通过分子手段和基因工程培育高WUE苹果新品种提供理论依据。从两个品种叶片中共鉴定到4078个蛋白,其中,2864个蛋白有iTRAQ定量信息。与正常供水植株叶片相比,594个蛋白在长期干旱处理的叶片中含量发生变化。干旱处理‘秦冠’苹果叶片中含量发生变化的蛋白中,参与光合途径的数目最多,表明干旱下通过对光合途径进行调控从而维持较高的净光合速率对于提高苹果WUE起关键作用。结果表明,干旱下‘秦冠’苹果维持高WUE的主要机制包括:提高卡尔文循环途径中关键酶的含量以维持较高的净光合速率;对光反应过程蛋白进行调控,有利于维持干旱下光合电子传递链电子与能量的正常运转,稳定光合电子传递,同时保证暗反应原料和能量的供应;光反应过程电子传递和能量运转的有效调控,结合光呼吸和氧化还原系统的调控,避免了光抑制的发生和过多活性氧的产生,从而避免对光合器官造成损害,保持光合组织的正常功能,保证较高的净光合速率。除光合途径有效调控的主导作用外,非生物逆境胁迫响应蛋白是在干旱处理‘秦冠’叶片中含量上升的第二大类蛋白,其中热激蛋白数量最多。其次有糖代谢、信号转导过程蛋白等,这些蛋白的调控有助于植物更好的适应干旱胁迫,缓解逆境伤害。2.蛋白组学检测中鉴定到MdAGO4.1蛋白含量在干旱处理的‘秦冠’苹果叶片中上调,MdAGO4.1蛋白是Argonaute(AGO)家族成员,AGO是小RNA引导的基因沉默途径的重要参与者,而小RNA介导的基因沉默在植物应对逆境胁迫过程中起重要作用。本研究从苹果基因组中鉴定到16个MdAGO基因,分为3个亚族,对其染色体定位、基因内含子/外显子结构、系统发生(进化)关系和保守结构域进行了分析。qRT-PCR结果表明,MdAGO基因受干旱、盐、冷胁迫及ABA处理的诱导,表明可以作为通过分子手段提高苹果抗逆性的候选基因。结合‘秦冠’和‘长富-2’的蛋白组研究结果和MdAGO4.1在WUE存在差异的苹果品种叶片中的基因表达分析(干旱处理后,MdAGO4.1基因表达水平在‘秦冠’中上调,在‘长富-2’苹果中没有变化,这与干旱对两个品种WUE及叶片中MdAGO4.1蛋白含量变化的影响一致),认为MdAGO4.1可能对苹果长期干旱下的WUE有调控作用。本项研究为苹果中MdAGO基因参与植株逆境响应的调控提供了一定证据,并为苹果中Argonaute家族功能研究提供了依据。3.蛋白组学检测鉴定到MdPYL9蛋白含量在干旱处理的两个品种苹果叶片中上调,MdPYL9蛋白是PYR/PYL/RCAR(简称PYL)家族成员,PYL是ABA受体,在ABA信号途径上游起关键作用,而ABA信号途径在植物应对逆境胁迫过程中起重要作用。本研究从苹果中鉴定到14个MdPYL基因,分为3个亚族,对其染色体定位、基因内含子/外显子结构、系统发生(进化)关系和保守结构域进行了分析。qRT-PCR结果表明,MdPYL基因受干旱、盐、冷胁迫及ABA处理的诱导,表明其可以作为改善苹果非生物逆境抗性的候选基因。结合‘秦冠’和‘长富-2’的蛋白组学研究结果和MdPYL9在不同品种苹果叶片中的基因表达分析(干旱处理后,MdPYL9表达水平在‘秦冠’和‘长富-2’中都上调,且MdPYL9蛋白含量在长期干旱后的‘秦冠’和‘长富-2’叶片中都上调),认为MdPYL9参与苹果对长期干旱处理的响应调控。对MdPYL1、MdPYL5、MdPYL7、MdPYL9进行了分子克隆。将蛋白组数据检测到上调并经过qRT-PCR验证的MdPYL9基因在‘GL-3’苹果中过表达。对过表达苹果植株进行50μM ABA处理,结果表明,与对照植株相比,过表达MdPYL9提高了苹果植株在该浓度ABA处理下的生长,而干旱下植物体内ABA含量上升,所以推测过表达MdPYL9会提高干旱下植株的生长,达到较高的WUE。本研究为苹果中MdPYL基因参与植株非生物逆境响应、干旱适应性和干旱下WUE的调控提供了一定证据,并为苹果中PYL家族的深入研究提供了依据。