论文部分内容阅读
由于抗生素耐药性病原体在全球范围内的出现,研发新型抑菌药物的需求日益增加。抗菌肽（Antibacteial peptides,AMPs）是一类在大多数生物体内都存在的阳离子小肽,具有广谱抗菌活性,且不易产生耐药性。目前常借助基因工程技术,选择易形成包涵体的融合标签构建载体,以包涵体（Inclusion body,IB）的形式通过大肠杆菌表达系统重组表达抗菌肽。本研究以Metchnikowin（Metch）、Maginin II（Mag II）、Andropin作为目的抗菌肽,棕榈酰磷脂转移酶（PagP）作为融合标签,通过1)缩短融合标签长度,降低融合蛋白的相对分子量;2)将融合标签上的相关位置的脯氨酸（Pro）突变成亮氨酸（Leu）或异亮氨酸（Ile）,提高抗菌肽相对表达量。融合标签和抗菌肽之间依次插入Ni+切割识别位点、His6-tag纯化标签及蛋白酶TEV识别位点（融合标签-NHT-AMPs）,构建相应表达载体,并利用大肠杆菌表达系统成功表达以下优化蛋白:P100-NHT-Metch、5-P100-NHT-Metch、10-P100-NHT-Metch、PagP-NHT-Andropin、5-P100-NHT-Andropin、10-P100-NHT-Andropin、127-PagP-NHT-Mag II、135-PagP-NHT-Mag II、121-123-PagP-NHT-Mag II、127-135-PagP-NHT-Mag II、121-123-135-PagP-NHT-Mag II、121-123-127-135-PagP-N-HT-Mag II、10-P100-NHT-Metch（P135L）、5-P100-NHT-Andropin（P135L）。表达的包涵体溶解后,用Ni+裂解融合蛋白,融合标签PagP和短肽HT-AMPs分离,融合标签经相应缓冲液稀释沉淀,短肽HT-AMPs经Ni-NTA纯化,再经TEV蛋白酶酶切,抗菌肽与融合标签彻底分离,继续使用CM-羧甲基纤维素阳离子交换柱脱盐,得到纯的抗菌肽。大肠杆菌的表达条件为37℃、12 h、诱导物IPTG终浓度0.3 mM;Ni+裂解融合蛋白需要终浓度510 mM、溶液蛋白浓度200μM、60℃反应24 h;TEV蛋白酶作用条件为25℃反应12 h。对表达结果进行相对定量分析,重构载体pZBR04、pZBR07、pZBR09表达后抗菌肽Metch的相对表达量分别增加30.6%、31.4%、39.7%;重构载体pZBR06、pZBR08、pZBR10表达后抗菌肽Andropin的相对表达量分别增加49.7%、47.2%、35.3%;重构突变载体pZBR17-pZBR22表达后抗菌肽Mag II表达量分别增加54.4%、60.5%、44.3%、36.7%、17.4%、31.4%。表达产物纯化后检测活性,结果显示Metch对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,Mag II、Andropin对大肠杆菌MG1655和金黄色葡萄球菌均具有较好的抗菌活性。本研究为提高抗菌肽表达量提供了可行性参考,有利于抗菌肽的产业化。