研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,已经成为女性癌症死亡的首要原因。近几十年来,全球乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势,仅2012年就有约170万女性被诊断患上乳腺癌,52.2万名患者死于此症。我国的乳腺癌发病率也逐年增长,以每年3%的增幅成为我国近10年增长速度最快的肿瘤,预计到2021年乳腺癌发病率能够达到250万,不仅严重影响女性的身体健康,还给家庭、社会带来了巨大的经济负担。雌激素受体(ER)的表达水平与乳腺癌的发生发展密切相关。雌激素结合ER,激活ER与雌激素应答元件(ERE)结合,起始多重基因转录,这些基因参与了乳腺癌细胞的增殖和分化。根据ER表达水平可将乳腺癌分为ER阳性和ER阴性,ER阳性乳腺癌约占65%,ERa表达水平决定着内分泌治疗甚至化疗效果。他莫昔芬作为内分泌治疗的经典药物,能够竞争性阻断雌激素与ER的结合,抑制ER阳性乳腺癌细胞的增殖。ER阴性乳腺癌由于ER表达缺失或低表达,对他莫昔芬治疗不敏感。此外,随着治疗的深入,部分ER阳性乳腺癌可能转为阴性,他莫昔芬失去疗效。因此,如何增加ER阴性乳腺癌他莫昔芬敏感性是乳腺癌治疗领域的研究热点。姜黄素是一种从姜科植物姜黄等根茎中提取的多酚类化合物,姜黄素具有抗凝血、降脂、利胆、抗氧化、抗肿瘤等作用。近年来,姜黄素在乳腺癌治疗中的应用研究得到广泛关注,例如,姜黄素激活自噬依赖性的Akt降解从而抑制ERa阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移；姜黄素抑制脂肪酸合酶活性诱导MDA-MB-231细胞凋亡；姜黄素与PARP抑制剂联合应用抑制MDA-MB-231细胞增殖;姜黄素通过降低NF-κB/AP-1转录活性从而抑制MDA-MB-231细胞增殖和侵袭,体内试验表明姜黄素有效地减少了乳腺癌的肺转移；此外,姜黄素还能够抑制其他转录因子的活性,包括TNFα、IL、STAT3和PPARy,它们由于调节着多重基因转录在乳腺癌发生过程中起着关键作用。SLUG又名Snai2,是一种锌指转录因子,通过与基因启动子区域的E-box (CANNTG)结合抑制基因转录。SLUG的表达水平与结肠癌、肺癌、卵巢癌等的不良预后密切相关。与其他亚型的乳腺癌相比,三阴性乳腺癌中SLUG表达最高。在ERa阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中过表达ERa,结合雌二醇作用,明显抑制SLUG的表达,相反,ERa阳性乳腺癌MCF7和T47D细胞中敲除ERa明显增加了SLUG的表达。近期,SLUG被发现参与了ERa的转录调控,但SLUG是否与ERa阴性乳腺癌他莫昔芬敏感性有关需要进一步证实。此外,姜黄素能否靶向SLUG有待于进一步研究。研究方法与结果本文旨在研究姜黄素在ERa阴性乳腺癌他莫昔芬敏感性及相关作用机制,主要包括以下研究内容：1、姜黄素对ERa阴性乳腺癌他莫昔芬敏感性的影响1.1、研究方法我们首先分析了姜黄素对ERa阳性和阴性乳腺癌的剂量效应与时间效应,随后,检测了4-羟基他莫昔芬对ERa阳性和阴性乳腺癌的剂量效应与时间效应,通过CCK8细胞增殖实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验及流式细胞分析分别检测细胞活性、细胞毒性及细胞凋亡,从而确定姜黄素和4-羟基他莫昔芬的准确作用浓度和作用时间,分析一定浓度的姜黄素和4-羟基他莫昔芬联合作用一定时间,明确姜黄素对ERa阴性乳腺癌他莫昔芬敏感性的影响。1.2、研究结果CCK8实验结果显示,姜黄素对ERa阴性乳腺癌的抑制作用相对于ERa阳性乳腺癌更加明显,相反,4-羟基他莫昔芬对ERa阳性乳腺癌的抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。我们分别选择5μM的姜黄素和10μM的4-羟基他莫昔芬作为后续作用浓度,LDH释放实验和流式细胞分析均证明姜黄素能够增加ERa阴性乳腺癌细胞对4-羟基他莫昔芬的敏感性。2、姜黄素促进ERa阴性乳腺癌细胞他莫昔芬敏感性的机制研究2.1研究方法我们通过western blot法检测分析了SLUG在ERa阳性和阴性乳腺癌细胞中的差异表达。随后,western blot分析了姜黄素和4-羟基他莫昔芬对SLUG表达的影响。通过荧光素酶报告实验和染色质免疫沉淀(ChIP)检测了SLUG对己糖激酶2(HK2)启动子的结合能力及转录活性。在ERa阴性乳腺癌细胞中通过小干扰RNA (siRNA)抑制SLUG表达,确定SLUG抑制在ERa阴性乳腺癌细胞他莫昔芬敏感性中的作用及对HK2蛋白表达的影响。在ERa阳性乳腺癌细胞中通过SLUG过表达,确定SLUG表达上调对ERa阳性乳腺癌细胞他莫昔芬敏感性的影响。通过分析姜黄素、4-羟基他莫昔芬对线粒体介导凋亡通路的关键蛋白mTOR磷酸化、细胞色素C的释放以及Caspase3的激活的影响,确定姜黄素联合4-羟基他莫昔芬是如何促进ERa阴性乳腺癌细胞凋亡的。2.2研究结果我们的结果显示,SLUG在ERa阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达明显高于ERa阴性乳腺癌细胞MCF7。姜黄素处理MDA-MB-231细胞剂量依赖式的抑制SLUG的表达,而4-羟基他莫昔芬却剂量依赖式的促进SLUG的表达,5μM的姜黄素和10μM的4-羟基他莫昔芬联合作用证实,姜黄素能够阻断4-羟基他莫昔芬对SLUG的促进作用。为了阐明SLUG在ERa阴性乳腺癌细胞中如何发挥作用,我们通过荧光素酶报告实验来分析SLUG对HK2的转录活性,结果显示SLUG能够识别HK2的启动子促进荧光素酶的表达。ChIP实验进一步证实SLUG能够与HK2启动子结合,说明SLUG直接参与了HK2的转录。RT-PCR结果显示姜黄素降低了HK2的mRNA水平,4-羟基他莫昔芬提升了HK2的mRNA水平,可能是由于它们对SLUG表达的作用差异所致。Western blot及流式细胞分析结果显示HK2在MDA-MB-231细胞中的表达明显高于MCF7细胞。在MDA-MB-231细胞中干扰SLUG的表达抑制了HK2的表达,同时也增加了细胞他莫昔芬敏感性。有意思的是,姜黄素和4-羟基他莫昔芬作用干扰SLUG的MDA-MB-231细胞或SLUG低表达的MCF7细胞对HK2的表达没有明显影响。相反,在MCF7细胞中过表达SLUG促进了HK2的表达,同时降低了细胞他莫昔芬敏感性。姜黄素和4-羟基他莫昔芬作用MDA-MB-231细胞或SLUG过表达的MCF7细胞分别抑制和提升了HK2的表达。这些结果说明,姜黄素对低表达SLUG细胞不敏感,但对高表达SLUG细胞抑制作用明显,而SLUG过表达有助于乳腺癌细胞对4-羟基他莫昔芬产生抗性,推测姜黄素可能靶向SLUG从而抑制HK2的表达,促进ERa阴性乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性。姜黄素与4-羟基他莫昔芬联合作用MDA-MB-231细胞能够有效抑制mTOR的磷酸化,促进细胞色素C从线粒体释放到胞质,激活Caspase3,这些结果说明,姜黄素与4-羟基他莫昔芬联合作用促进了线粒体介导的细胞凋亡,表明姜黄素促进了MDA-MB-231细胞对4-羟基他莫昔芬的敏感性。3、SLUG和HK2在ERa阳性和阴性乳腺癌组织中差异表达分析3.1研究方法我们通过荧光定量PCR验证了SLUG和HK2在ERa阳性和阴性乳腺癌组织中的表达情况,并通过Western blot和免疫组织化学染色进行进一步确认。3.2研究结果我们选取了ERa阳性和阴性乳腺癌组织各34例,首先通过荧光定量PCR分析了SLUG的差异表达。结果显示SLUG在ERa阴性乳腺癌组织中的表达明显高于ERα阳性乳腺癌组织。免疫组化法和Western blot结果也证实SLUG在ERa阴性乳腺癌组织中表达更高。我们进一步检测了HK2在所选ERa阳性和阴性乳腺癌组织中的差异表达。荧光定量PCR结果显示,HK2在ERa阴性乳腺癌中的表达高于ERa阳性乳腺癌,免疫组化法进一步证实这一结果。Western blot结果显示,在所选组织中,HK2在ERa阴性乳腺癌中的表达确实高于ERa阳性乳腺癌。将所得SLUG和HK2表达数据结合临床标本的详细信息,我们发现,ERa阳性乳腺癌中SLUG的表达率达到76.47%,SLUG的表达与Era呈负相关。无论Era的表达是阳性还是阴性,SLUG的表达与肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移都呈正相关,由此,Slug的表达可能促进肿瘤的生长和淋巴结转移,是乳腺癌治疗的潜在靶点。结论：1、姜黄素对ERa阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制效率明显高于ERa阳性乳腺癌MCF7细胞。2、姜黄素能够增加ERa阴性乳腺癌细胞对4-羟基他莫昔芬的敏感性。3、姜黄素能够抑制SLUG/己糖激酶2通路,从而促进ERa阴性乳腺癌细胞对4-羟基他莫昔芬敏感。4、SLUG能够直接与己糖激酶2的启动子区结合,激活己糖激酶2的转录。5、SLUG有助于削弱ERa阴性乳腺癌细胞的4-羟基他莫昔芬敏感性,姜黄素靶向SLUG增加ERa阴性乳腺癌细胞对4-羟基他莫昔芬敏感性。6、SLUG和己糖激酶2在ERa阴性乳腺癌组织中的表达明显高于ERa阳性乳腺癌组织。意义：1、证实姜黄素能够增加ERα阴性乳腺癌细胞对4-羟基他莫昔芬的敏感性,提示姜黄素具有作为他莫昔芬联合辅助因子在临床中的应用潜力。2、发现了姜黄素促进ERα阴性乳腺癌细胞对4-羟基他莫昔芬敏感的新机制。3.揭示了姜黄素新的作用靶点。