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叶片是植物进行光合作用的主要器官,叶绿体是植物光合作用重要的细胞器,而叶绿素是植物光合色素的主要成份,也是植物光合作用吸收光能的主要载体。许多叶色突变与叶绿体发育、叶绿素合成代谢的异常有关。高等植物叶绿素合成是一个非常复杂的过程,从谷氨酰-tRNA到叶绿素a和叶绿素b的生物合成涉及一系列的酶参与反应,其中镁原卟啉Ⅸ单甲酯环化酶(MgPME)是叶绿素生物合成的关键酶,催化镁原卟啉单酯ⅨX转换为联乙烯原叶绿素酸酯a,在碳环的形成过程中发挥着重要的作用。本研究通过EMS诱变粳稻品种日本晴获得一份黄绿叶突变体577ys,在前期对该突变体定位的基础上对其候选基因进行筛选、基因克隆及功能分析,主要结果如下:(1)表型特征和农艺性状:577ys在整个生育期内叶片表现为黄绿色,且生长缓慢,叶片在苗期出现锈斑,抽穗期锈斑减少,成熟期锈斑不明显。农艺性状调查结果显示:与野生型相比,577ys突变体株高、每穗着粒数和千粒重均极显著下降,分别降低了 18.3%、31.7%和11.8%,单株有效穗数、穗长和结实率分别降低了 10.8%、7.1%和 7.4%。(2)光合色素含量的测定:577ys突变体苗期和孕穗期光合色素含量都极显著下降,其中苗期总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别下降了 81.9%、79.1%、91.9%和64.7%;孕穗期总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别下降了 59.5%、53.2%、82.1%和46.4%。表明577ys基因的突变严重影响了其光合色素的合成。(3)叶绿体超微结构观察:取苗期叶片进行透射电镜观察,结果显示:与野生型相比,577ys叶绿体较为肿大,类囊体发育紊乱,基粒数目明显减少、形态混乱不规则且无明显垛叠,叶绿体内嗜锇粒明显增多。表明577ys突变体的叶绿体发育受到抑制。(4)候选基因的遴选与克隆:本实验室前期工作已将577ys定位于水稻第1染色体短臂上约105.4kb范围内,该区域含有13个预测基因。在此基础上,通过PCR扩增并测序,结果显示LOC_Os01g17170基因在基因组419位,对应CDS为419位由C突变为T,导致编码氨基酸第140位由苏氨酸突变为异亮氨酸,该基因编码镁原卟啉Ⅸ单甲酯环化酶。(5)转基因功能互补验证:构建pC2300-LOC_Os01g17170转基因表达载体,通过农杆菌介导法转入突变体577ys中,获得的转基因阳性植株都表现为绿色,说明577ys黄化突变性状是由LOC_Os01g17170基因突变造成。(6)组织表达分析:运用RT-PCR,对577YS基因在不同时期的组织表达进行了检测,结果显示该基因在叶、茎、叶鞘和幼穗中都有表达,其中叶中表达量最高。(7)亚细胞定位:构建pC2300-LOC_Os01g17170-eGFP表达载体,通过PEG介导将该载体转入水稻原生质体中瞬时表达,结果显示:pC2300-LOC_Os01g17170-eGFP表达的蛋白质绿色荧光与叶绿素红色自荧光重合,表明577YS蛋白定位于叶绿体上。(8)台盼蓝染色:取分蘖期577ys突变体与野生型相同部位叶片进行台盼蓝染色,结果显示突变体叶片局部有深蓝色着色斑,表明突变体锈斑处细胞死亡。