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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是危害世界养猪生产的重要病原,并造成巨大的经济损失。其核衣壳蛋白(N蛋白)是病毒粒子重要的内部结构蛋白及免疫原性蛋白,参与病毒RNA合成及感染性病毒颗粒装配,且N蛋白核定位(Nuclear Localization Signal, NLS)与PRRSV致病性密切相关。SUMO是一类重要的类泛素蛋白,广泛参与生物体生命活动,病毒蛋白的SUMO化修饰在抑制宿主先天性免疫、参与病毒免疫逃逸及复制中发挥重要作用。本论文围绕PRRSV N蛋白SUMO化修饰对病毒体外复制、N蛋白亚细胞定位和抑制β干扰素产生的影响开展研究,旨在从蛋白翻译后修饰的新视角为PRRSV致病机制研究提供线索,也为抗PRRSV药物研发提供新靶点。为了验证PRRSV蛋白的SUMO化修饰,利用分析软件SUMOSp1.0a、SUMOplot和seeSUMO进行预测,并以SUMOE2结合酶Ubc9蛋白作为“诱饵”蛋白,采用酵母回复杂交技术筛选,发现Ubc9与PRRSV的Nsp1β、Nsp4、Nsp9、Nsp10及N存在相互作用。进一步利用免疫共沉淀(Co-IP)、GST pull-down和激光共聚焦技术证实Ubc9与上述蛋白存在互作。为了分析Ubc9对PRRSV体外复制和基因组RNA合成的影响,利用RNA干扰和慢病毒包装技术分别沉默和过表达MARC-145细胞中Ubc9,结果显示,MARC-145细胞中过表达Ubc9在24 h可显著抑制PRRSV复制(尸<0.01)及在24 h和36 h显著抑制PRRSV基因组RNA的合成(P<0.001)。最后,为了分析SUMO化抑制剂是否有利于PRRSV复制,银杏酸(Ginkgolic acid, GA)处理MARC-145细胞4 h,数据显示,PRRSV在12 h和24 h于GA处理后的MARC-145细胞中的复制能力显著高于对照组。为了阐明PRRSV N蛋白SUMO化修饰的途径,利用定点突变技术对N蛋白中的赖氨酸进行组合突变,发现只有当N蛋白中的赖氨酸全部突变为精氨酸时,SUMO化修饰现象才消失,突变其任何一点或多点赖氨酸N蛋白仍能发生SUMO化修饰,由此证明N蛋白赖氨酸对其SUMO 化修饰是冗余的。PIAS1 (Protein inhibitor of activated STAT1)作为一种 SUMO E3 连接酶,可以促进靶蛋白的SUMO化修饰,进而影响靶蛋白的功能,参与基因转录调控过程。本研究利用SUMO化修饰体外检测试剂盒和免疫共沉淀技术对N蛋白SUMO修饰途径进行鉴定,验证PIAS1与N蛋白的相互作用以及分析PIAS1在N蛋白SUMO化修饰及PRRSV复制中的作用。研究结果表明,PIAS1能与N蛋白相互作用,两者共定位于胞浆中;外源转染PIAS1不能增加N蛋白SUMO化修饰水平;在MARC-145细胞中,PIAS1的表达有利于PRRSV的复制。鉴于赖氨酸对N蛋白SUMO化修饰是冗余的,本研究构建了系列N蛋白赖氨酸突变体并拯救病毒,进一步验证N蛋白中赖氨酸与其亚细胞定位、干扰素产生和PRRSV复制之间的相关性。基于赖氨酸在N蛋白中的分布,以pCMV-HA-N为模板,利用定点突变技术构建出系列N蛋白赖氨酸突变体;同时,以PRRSV高致病性毒株JXwn06的感染性cDNA克隆(pWSK-JXwn)为骨架,定点突变N蛋白中的赖氨酸,共拯救出6株N蛋白赖氨酸突变病毒,分别命名为RvJXwn、RvJXNK7,28,39,52R、RvJXNmutNLS1、RvJXNmutNLS2、RvJXNmutNLS1,2 和 RvJXNKR。分析突变体拯救病毒在MARC-145细胞和原代PAMs细胞上的增殖动态,发现当位于N蛋白NLS1、NLS2、NLS1,2上的赖氨酸及N蛋白中的全部赖氨酸突变为精氨酸后,突变体拯救病毒的体外增殖能力显著低于亲本病毒RvJXwn。利用激光共聚焦方法观察N蛋白赖氨酸突变体及突变体拯救病毒的亚细胞定位,结果表明,野生型N蛋白和NmutNLS2位于细胞核核仁,而其余N蛋白赖氨酸突变体则分布在细胞核除核仁外的核质中;突变体拯救病毒N蛋白则同亲本病毒一样分布于细胞核核仁和胞浆中。利用双荧光素试验分析N蛋白及其赖氨酸突变体对IFN-β和IRFs启动子活性的影响,证实NK7,28,39,52R和野生型N蛋白一样可以抑制IFN-β和IRFs启动子活性,而其余N蛋白赖氨酸突变体对IFN-β和IRFs启动子活性的抑制能力明显减弱。针对突变体拯救病毒在MARC-145细胞和原代PAMs细胞诱导产生IFN-β能力的检测结果表明,不同突变体拯救病毒感染宿主细胞诱导产生IFN-β的能力有明显差异,其中RvJXNmutNLS1、RvJXNmutNLS2、RvJXNmutNLS1,2 和 RvJXNKR 在感染后 24 h 和 36h诱导产生 IFN-β 水平极显著高于亲本病毒RvJXwn(P<0.001 ),而RvJXNK7,28,39,52R与亲本病毒差异不显著(P>0.05)。综上,本研究验证了 PRRSVNsp1β、Nsp4、Nsp9、Nsp10及N蛋白与宿主细胞蛋白Ubc9存在相互作用,证实了 PRRSVN蛋白存在SUMO化修饰现象,并确定赖氨酸对N蛋白SUMO化修饰是冗余的。通过构建N蛋白赖氨酸突变体及拯救其突变病毒,证实N蛋白赖氨酸突变体可影响IFN-β和IRFs启动子活性及改变N蛋白的亚细胞定位;除第7,28,39,52位赖氨酸外,N蛋白其余赖氨酸与病毒的体外增殖能力密切相关,且与诱导IFN-β水平有关。