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研究背景:在口腔正畸临床工作中,经常会遇到上颌宽度发育不足的患者,这是常见的一类错(?)畸形。它主要表现为上颌牙弓狭窄,伴或不伴后牙的反(?)或对(?),可导致发音障碍,咀嚼困难,颌骨功能紊乱,影响患者美观并对患者造成心理障碍等。为矫治这类错颌畸形,临床工作中常使用上颌快速扩弓(rapid maxilla expansion,RME)的方法,即通过使用扩大螺旋弹簧进行加力,在短期内可打开腭中缝处的纤维组织连接,加上腭部骨组织改建比较活跃,从而可以扩大上颌骨及牙弓的宽度,达到矫形治疗的目的。但是RME这一矫治方法存在不足。在多数情况下,新生的骨质很不稳定,易受多种因素影响而再次发生吸收,可致上颌骨、牙弓等宽度再次变窄,导致畸形复发。由于腭中缝处新生的骨质完全沉积矿化需要较长的时间,为减少复发现象的发生,临床工作中不得不延长矫治时间,这会给临床医生及患者带来不便。因此,如何促进新骨的形成、钙化,减少新骨的吸收,是缩短临床治疗时间、降低扩弓后复发率的关键。目前关于促进扩弓后腭中缝骨改建的研究多集中在生长因子、药物及物理刺激等方面,相关机制研究较少,尚无研究从基因转录后水平探讨腭中缝骨改建的影响因素。microRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的内源性非编码RNA分子,目前研究发现其主要在转录后水平发挥调控基因表达的作用。miRNA广泛参与生命活动中一系列的重要进程,包括细胞的增殖和分化、个体的生长发育以及疾病的发生发展等。许多体内及体外实验研究表明microRNA-21(miR-21)与干细胞的成骨向分化密切相关。课题组前期通过基因芯片结果分析发现,miR-21靶基因显著富集于与成骨分化相关的信号通路。此外,前期的体外实验已证实miR-21可促进机械力作用下的牙周膜干细胞成骨向分化。但miR-21对扩弓作用引起的腭中缝组织骨改建的作用尚不明确。在本实验研究中,将从基因水平分析miR-21 对快速扩弓后腭中缝骨组织改建的影响。实验目的:本研究通过单眼圈簧扩弓装置分别建立miRNA-21敲基因(miR-21-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠的上颌快速扩弓模型,分析miR-21在小鼠上颌快速扩弓后腭中缝处骨改建中的作用,为正畸临床RME中,促进上颌骨腭中缝处骨组织改建,缩短临床矫治时间,提供一定的理论依据。实验方法:购买miR-21-/-小鼠及野生型小鼠,应用琼脂糖凝胶电泳及实时定量PCR技术验证基因型。对100只实验动物进行分组:按基因型分为两组,即:50只WT小鼠(A组)、50只miR-21-/-小鼠(B组),各组根据是否进行扩弓处理又分为两个亚组,即:未扩弓组(对照组:A1组和B1组)和扩弓组(实验组:A2组和B2组)。扩弓组(A2组和B2组)小鼠均在腭板上安置单眼圈簧扩弓装置,初始力值0.49N,并用光固化树脂分别将左右侧三个磨牙粘接成一整体。实验第1、3、7、14、28天,分批处死小鼠,解剖出小鼠上颌腭部组织,并进行组织切片;部分腭中缝组织切片行HE染色,观察各组小鼠腭中缝处组织的形态结构变化;部分切片进行TRAP染色,观察小鼠腭中缝组织中破骨细胞位置及数目;部分切片行免疫组织化学染色法检测小鼠腭中缝组织中ALP、OCN、OPG、RANKL的表达并进行光密度分析。应用SPSS 19.0软件进行统计学分析(单因素方差分析),P<0.05为有统计学差异。实验结果:1.通过琼脂糖凝胶电泳及实时定量PCR检测结果显示,miR-21-/-小鼠中miR-21不表达,WT小鼠中有miR-21表达,基因敲除成功。2.体重观察:A1组和B1组小鼠体重稳步增加,而A2组和B2组小鼠在安置扩弓器后的第2天和第3天体重下降,第4天后小鼠体重开始逐渐增长。在实验期间,扩弓组(A2组和B2组)小鼠的平均体重均小于未扩弓组(A1组和B1组)小鼠的平均体重(P<0.05),而各组内小鼠(A1组和B1组、A2组和B2组)的平均体重在扩弓期间无显著差异(P<0.05)。3.苏木精-伊红染色显示:未扩弓组(A1组和B1组)小鼠腭中缝处结构层次清楚,各时间点结构相似,无明显变化。扩弓组(A2组和B2组)小鼠在扩弓力的作用下,红染的纤维组织被牵拉伸长,沿扩弓力的方向增生,骨膜细胞向腭中缝区域迁移,骨表面的成骨细胞数量增多,骨形成活跃,两侧的软骨细胞逐渐减少。在扩弓加力的第14天和第28天,A2组小鼠比B2组小鼠新生的骨组织多,恢复组织层次能力强。4.TRAP染色显示:在生理状态下,A1组和B1组小鼠腭中缝处破骨细胞较少,B1组破骨细胞数目显著少于A1组。在扩弓力的作用下,A2组和B2组小鼠破骨细胞数目明显增多,多集中在鼻腔侧及骨缝边缘处;B2组小鼠破骨细胞增多更明显。5.免疫组织化学染色显示:在A1组和B1组小鼠腭中缝处ALP、OCN等成骨基因的表达多集中在骨缝边缘。非机械力作用下,A1组与B1组ALP的表达量在实验前期无明显差异,而扩弓第28天,B1组表达量高于A1组。扩弓力的作用下,A2组小鼠中ALP基因的表达在前期比B2组明显增多,但在后期由于A2组小鼠基本恢复组织形态,其表达量下降,B2组小鼠成骨细胞增多,表达量上升(P<0.05)。在腭中缝区域,A1、A2组OCN的表达量明显高于B1、B2组。A1组小鼠腭中缝处RANKL/OPG比值明显高于B1组,B2组小鼠RANKL/OPG比值明显高于A2组(P<0.05)。结论:1.无机械力刺激时,miR-21-/-小鼠和WT小鼠在成骨作用中的差异较小,WT小鼠的成骨能力较强,同时破骨能力也较强;敲除miR-21-/-能够抑制小鼠上颌腭中缝组织的破骨细胞形成,抑制破骨的作用。2.在RME扩弓力的作用下,miR-21-/-小鼠和WT小鼠在成骨方面的作用差异较大,miR-21--小鼠能够迟缓上颌腭中缝处成骨细胞的形成,延长成骨时间。在机械力作用下,由于机体自身的成骨与破骨之间的平衡被打破,WT小鼠的成骨细胞数量多于破骨细胞,破骨作用较弱,而miR-21-/-小鼠中破骨细胞数目较多。3.miR-21可以促进小鼠上颌快速扩弓时腭中缝处的骨组织形成。