急性肺损伤(acute lung injure ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratory distress syndrome ARDS)是临床上危重病人严重的并发症和重要的死亡原因，其相关的死亡率仍高达40%，治疗效果差，与其发病机制复杂有关。急性肺损伤的病理基础包括有过度、持续的肺泡炎症伴有肺泡上皮细胞受损甚至死亡。肺泡上皮细胞(Alveolar epithelial cellsAECs)是致病原攻击的首要靶细胞，也是炎症活化细胞和效应细胞，能被LPS激活，释放IL-8, IL-6, TNF-α, ICAM-1等炎症介质，进而引起细胞的结构损伤、功能障碍和凋亡、坏死等改变，A549细胞广泛应用于肺泡上皮细胞的损伤-保护机制研究中。2008年三个独立的研究小组分别采用不同的实验研究和理论预测的策略，验证TMEM16A可能为CaCC的分子基础，CaCCs属于阴离子通道，在不同的组织器官起着各种各样的作用，在体和体外试验均证实TMEM16A是钙离子依赖性氯离子分泌所必须的。TMEM16A高表达能够抑制囊性纤维化患者气道上皮细胞分泌炎症因子IL-8。我们前期的研究发现TMEM16A表达于大鼠正常肺泡上皮细胞，大肠杆菌气道注入复制的急性肺损伤大鼠模型肺组织内TMEM16A蛋白较正常大鼠的表达水平减低，推测TMEM16A在急性肺损伤中起作用。人Ⅱ型上皮细胞是否表达TMEM16A，在LPS诱导的急性肺泡上皮损伤中TMEM16A表达有何变化，TMEM16A对急性肺损伤中肺泡上皮细胞分泌炎性因子、凋亡的影响是我们在试验中拟解决的问题。本课题以肺泡Ⅱ型上皮细胞A549为研究对象，以分子生物学及细胞生物学相关技术为手段，系统研究了以下几方面内容：（1）LPS刺激诱导急性上皮损伤模型的建立。观察TMEM16A蛋白在A549中的表达及LPS刺激对TMEM16A表达的影响。（2）稳定表达TMEM16A蛋白的A549细胞株的建立及其鉴定。（3）过表达TMEM16A对LPS诱导A549细胞分泌炎性因子及细胞凋亡的作用。（4）siRNA干扰TMEM16A对LPS诱导A549细胞分泌炎性因子的作用。论文具体内容如下：第一部分脂多糖刺激下TMEM16A在人Ⅱ型肺泡上皮细胞中表达的调控目的：复制LPS诱导肺泡上皮急性损伤模型，观察在Ⅱ型肺泡上皮细胞急性损伤时TMEM16A的变化，验证TMEM16A是否表达于人Ⅱ型肺泡上皮细胞，是否参与了急性肺损伤过程。方法：以LPS刺激A549细胞，ELISA法检测细胞培养上清液TNF-α水平，用Annexin V-FITC/PI双染细胞经FCM测细胞的凋亡情况，透射电镜观察细胞的超微结构变化，以此验证LPS诱导肺泡上皮急性损伤模型复制成功。加入LPS前和加入刺激后6h、12h、24h、36h、48h分别收集细胞，提取蛋白，定量，用western blots法测定指定时间点TMEM16A蛋白表达。结果：1LPS刺激可诱导急性肺泡上皮损伤。⑴LPS刺激前及刺激后3，6，12，24h共五个时相点TNF-α水平有统计学差异，与未受刺激的A549细胞相比，LPS刺激的A549细胞的TNF-α水平于刺激后3，6，12，24h四个时相点显著升高，并以6h上调水平最高。⑵透射电镜观察：LPS刺激的A549细胞表面的微绒毛减少，细胞内可见大量的空泡，线粒体部分嵴和少部分膜融合，模糊不清，可见嵴缺失。粗面内质网轻度扩张，可见颗粒融合及脱颗粒现象。⑶LPS刺激24小时后早期凋亡和晚期凋亡、坏死明显增加。2A549细胞表达有TMEM16A蛋白，LPS刺激后6小时，12小时TMEM16A的表达量与加刺激前组相比无差异，LPS刺激后24小时、36小时TMEM16A的表达量明显增高，与加刺激前组相比有统计学差异。LPS刺激后48小时TMEM16A的表达量明显减低，与加刺激前组相比有统计学差异（P<0.05）。结论：脂多糖可诱导A549细胞活化，分泌TNF-α，诱导其早期、晚期凋亡，加剧细胞损伤，成功建立了脂多糖诱导的急性肺泡上皮损伤模型，并发现TMEM16A在Ⅱ型肺泡上皮细胞中有表达，并且在脂多糖诱导下TMEM16A蛋白表达水平有动态改变，提示TMEM16A参与了急性肺泡上皮损伤过程。第二部分TMEM16A高表达抑制脂多糖诱导A549分泌炎性因子及凋亡目的：建立TMEM16A稳定高表达的A549细胞株，研究TMEM16A过表达对LPS诱导A549急性损伤时炎性因子的分泌及细胞凋亡的影响。方法：将TMEM16A-pCMV6-Kan/Neo重组质粒扩增后，碱裂解法抽提，获得较多量的质粒，通过脂质体2000，将TMEM16A基因转至A549细胞，经G418筛选，単克隆化，并经实时定量PCR，免疫印迹验证建立TMEM16A稳定高表达的细胞株。采用ELASA方法测定不同处理组分泌的炎症因子TNF-α、IL-8水平。采用AnnexinV-FITC/Pl双染法应用流式细胞分析仪检测不同处理组间的细胞凋亡率的情况。结果：1pCMV-TMEM16A经脂质体2000转染至A549细胞，再经G418筛选，単克隆化，实时定量PCR显示：未处理的A549组、pCMV6空载体阴性对照组和pCMV6-TMEM16转染组三组间相对mRNA水平有显著性差异，其中pCMV6-TMEM16A转染组明显高于未处理的A549组及pCMV6空载体阴性对照组。而未处理的A549组及pCMV6空载体阴性对照组两组间无显著性差异。Western blot分析发现，pCMV-TMEM16AA549细胞在114KD左右能检测到明显的蛋白条带，而A549及pCMV6空载体阴性对照组仅见少量内源性TMEM16A蛋白表达，定量分析显示：三组间TMEM16A蛋白表达水平有显著性差异，其中pCMV6-TMEM16A转染组明显高于未处理的A549组及pCMV6空载体阴性对照组，而A549组及pCMV6空载体阴性对照组间无统计学差异，提示外源性TMEM16A基因已整合入A549细胞并稳定表达蛋白，成功建立了TMEM16A稳定高表达的A549细胞株。2无LPS刺激时，上述三组细胞在各个时相TNF-α，IL-8水平无统计学差异，在LPS刺激下三组TNF-α，IL-8水平在多个时相均显著增高，但TMEM16A的高表达组与其它两组相比，在相同时相TNF-α,IL-8水平显著降低。即TMEM16A高表达能明显下调但不能完全阻断LPS诱导的A549细胞分泌TNF-α、IL-8的作用。3在无LPS刺激时，A549细胞、pCMV空载体转染的A549细胞与TMEM16A稳定高表达的A549细胞相比三组间细胞早期、晚期/坏死凋亡率无统计学差异。说明在无LPS刺激时TMEM16A高表达不影响细胞的凋亡。三组细胞在LPS刺激24小时后与刺激前相比，细胞的早期、晚期凋亡/坏死率均显著增高，即LPS作用于上述三组细胞24小时均可使其早期、晚期/坏死凋亡率凋亡率明显增加。在LPS刺激24小时后，三组间的早期凋亡有统计学差异，其中A549细胞与pCMV空载体转染的A549细胞的早期凋亡无统计学差异，而TMEM16A高表达的A549细胞组比A549细胞组、pCMV空载体转染的A549细胞的细胞早期凋亡率降低。在LPS刺激24小时后，三组间的晚期凋亡及坏死率间无统计学差异。说明pCMV空载体转染不影响LPS诱导的A549细胞凋亡的改变，TMEM16A的高表达却可明显的减低LPS诱导的细胞早期凋亡。文中以P<0.05为差异有统计学意义。结论：成功建立了TMEM16A稳定高表达的A549细胞株，TMEM16A高表达可明显抑制脂多糖诱导肺泡上皮细胞活化分泌炎性因子及细胞早期凋亡。第三部分慢病毒介导RNAi敲除TMEM16A对脂多糖诱导的A549分泌炎性因子的作用目的:慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)人肺泡Ⅱ型上皮株A549细胞TMEM16A表达，研究TMEM16A基因敲除对LPS诱导A549急性损伤时炎性因子的分泌的影响。方法:委托上海吉凯基因公司，设计并制备出4条针对TMEM16A基因的RNAi序列及1条阴性对照序列，分别与GV115-GFP载体连接，构建5个重组慢病毒表达载体TMEM16A-RNAi-LV1#，TMEM16A-RNAi-LV2#， TMEM16A-RNAi-LV3#， TMEM16A-RNAi-LV4#和Screamble-RNAi；将连接产物转化到DH5α感受态细胞，经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。将重组慢病毒载体、pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将包装产生的5种重组慢病毒分别感染A549细胞，荧光显微镜下了解感染效率，并经western blots检测显示TMEM16A-RNAi-LV3#消减TMEM16A的效率最高，故选用TMEM16A-RNAi-LV3#进行后续试验，下文中TMEM16A-RNAi-LV即指TMEM16A-RNAi-LV3#，实时定量PCR和免疫印迹检测TMEM16A-RNAi-LV感染的A549细胞TMEM16A mRNA和蛋白的表达，并与未感染的A549细胞及Scr-RNAi-LV感染细胞进行比较。采用ELISA法测定非感染A549细胞组(A549)，Scr-RNAi-LV感染组（RNA干扰阴性对照组RNC），TMEM16A-RNAi-LV感染组(TMEM16A基因敲减组KD)收集的细胞培养上清液中的TNF-α、IL-8水平并做比较。结果:1荧光显微镜显示重组慢病毒载体转染A549细胞72小时后，TMEM16A-RNAi-LV1#，TMEM16A-RNAi-LV2#，TMEM16A-RNAi-LV3#感染组均表达绿色荧光蛋白，表示成功转入了A549细胞，而TMEM16A-RNAi-LV4#感染组未见荧光，提示未能成功转入了A549细胞。2对TMEM16A-RNAi-LV1#，TMEM16A-RNAi-LV2#，TMEM16A-RNAi-LV3#感染的A549行western blot检验，发现TMEM16A-RNAi-LV3#对TMEM16A蛋白表达的抑制明显，所以选用TMEM16A-RNAi-LV3#进行下步试验。3将TMEM16A-RNAi-LV、Scr-RNAi-LV感染A549细胞，并与未感染的A549细胞相比较发现TMEM16A-RNAi-LV感染组TMEM16A基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降(P<0.05)。4无LPS刺激时，上述三组细胞在各个时相TNF-α，IL-8水平无统计学差异，说明TMEM16A基因消减不影响Ⅱ型上皮细胞分泌TNF-α，IL-8。在LPS刺激下三组TNF-α，IL-8水平在多个时相均显著增高，并且TMEM16A消减组与其它两组相比，在相同时相TNF-α,IL-8水平显著增高，说明TMEM16A的消减明显加强了TNF-α、IL-8分泌，即TMEM16A的消减能明显促进LPS诱导的A549细胞TNF-α、IL-8分泌的作用。结论:成功构建并经筛靶找出了针对TMEM16A基因的慢病毒载体TMEM16A-RNAi-LV,体外感染A549细胞后可有效抑制TMEM16A基因和蛋白的表达。TMEM16A的消减能明显促进LPS诱导的A549细胞TNF-α、IL-8的分泌。