可自募TGF-β1的GelMA水凝胶支架的制备及其在软骨损伤修复中的应用

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目的:制备可自募转化生长因子-beta1(TGF-β1)的GelMA(Gelatin methacryloyl)水凝胶支架,探究其对间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSCs)的成软骨分化的作用以及在兔子膝关节软骨全层缺损修复的效果。  方法:(1)制备GelMA和含有具有吸附TGF-β1功能的HSNGLPL多肽的GelMA(GelMA/HSNGLPL)水凝胶支架材料,并对其表面特貌进行表征。(2)测定两组水凝胶流体性质、膨胀性能等物理性能;通过CCK-8法、活死染色法测定材料生物相容性;通过TGF-β1免疫荧光组化检测两组材料吸附TGF-β1的功能,两组水凝胶吸附TGF-β1后加入不完全成软骨诱导培养基诱导间充质干细胞,3天后实时荧光定量PCR(q-PCR)定量检测软骨相关基因的表达、7天番红O快绿组织学染色检测细胞胶原表达。(3)体内实验,制备兔子膝关节全层软骨缺损模型并进行相应干预,分为四组:假手术组(A组)、造模组(B组)、GelMA材料对照组(C组)以及GelMA/HSNGLPL材料实验组(D组),术后4周、8周分别取材进行大体观察、Micro-CT、HE染色、甲苯胺蓝染色以及二型胶原(colII)免疫组化染色分析,评估GelMA/HSNGLPL生物支架材料对软骨全层缺损模型的修复作用。  结果:(1)将制备好的GelMA和GelMA/HSNGLPL吸附多肽水凝胶支架材料保存于4℃备用,通过扫描电镜显示两组材料具有相似的表面特征,孔径在100-150μm之间。(2)测定流体性能、膨胀比,表明加入该HSNGLPL吸附多肽并没有影响胶体本身的理化性质;CCK-8法结果显示材料对细胞的贴附、增殖均没有影响,说明材料无细胞毒性;活死染色法检测两组荧光图像中几乎不存在红色荧光(死细胞),证明本实验中材料具有很好的生物相容性。将两组材料置于相同浓度TGF-β1下吸附1小时后弃去游离TGF-β1,对两组材料以及培养皿上间充质干细胞成软骨分化,PCR结果显示,GelMA/HSNGLPL材料比GelMA材料以及培养板上软骨相关基因有更高的表达,番红O快绿染色也呈现与PCR相同的结果,显示GelMA/HSNGLPL材料有更好的促进间充质干细胞的成软骨作用。(3)兔膝关节软骨全层缺损模型修复实验中,结果显示,术后4周D组软骨缺损处新生组织明显多于B、C三组且以软骨组织居多,表面也相对光滑;BV/TV值以及组织学评分显示D组相对于其他两组有更好的修复效果,与A组值最为相近;术后8周三组缺损部位基本都被新生组织覆盖,但B组相对于C、D两组,新生组织与周围正常组织有明显的界限,并且表面表现为乳白色,大多为纤维组织,无光泽且粗糙不平,D组修复组织以透明样软骨细胞为主,与A组表现最为相似。  结论:成功获得可自募集TGF-β1的GelMA/HSNGLPL水凝胶,相对于GelMA材料自身的性能没有改变,且体外以及体内实验显示该材料对于软骨缺损修复有更好的促进作用,为软骨组织工程治疗软骨缺损的临床应用开辟了新途径。
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