目的:1、采取腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法,创建糖尿病感觉神经病变大鼠模型,研究糖尿病感觉神经病变大鼠在急性心肌缺血/再灌注(I/R)期间心脏功能改变和心肌I/R损伤的程度,以及缺血区心肌组织、脊髓及背根神经节(DRG)中降钙素基因相关肽(CGRP)表达变化。2、以慢病毒为载体,评价心肌注射法和蛛网膜下腔注射法转导CGRP基因的可行性,研究其对糖尿病感觉神经病变大鼠在急性心肌I/R期间心脏功能改变和心肌I/R损伤的影响,以及缺血区心肌组织、脊髓及DRG中CGRP转录和表达变化。方法:研究从以下方面进行:1、糖尿病感觉神经病变大鼠模型的创建。2月龄清洁级健康雄性SD大鼠24只(200~220g),随机数字表法分为对照组(Control组)和糖尿病组(DM组),各12只,均常规饲料喂养9周。第1周末,DM组大鼠禁食12h,腹腔注射STZ(50mg/kg),诱导胰岛β细胞损伤,给药24h后每天定时测空腹血糖,7次空腹血糖值均>16.7mmol/L为糖尿病大鼠造模成功。每周测定大鼠体重和甩尾反射潜伏期,比较二者随病程的变化情况。第9周末,分析心肌I/R期间两组心率(HR)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室内压最大上升速率(+dP/dtmax)以及左心室内压最大下降速率(-dP/dtmax),比较急性心肌I/R期间心脏功能的改变。采用Evans蓝+TTC双染色的方法测定心肌缺血危险区及梗死区面积。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)对缺血区心肌组织、血清、脊髓及DRG中CGRP蛋白的表达进行定量分析。2、心肌CGRP基因转导对糖尿病大鼠心肌I/R损伤的实验研究。实验分为5组:对照(Control)组、糖尿病(DM)组、DM心肌注射手术(Sham)组、DM心肌注射对照(MC)组、DM心脏转导(ME)组。上文相同喂养条件,共历时10周。第1周末,水合氯醛腹腔麻醉,在机械通气下,开胸行大鼠心肌点注射转导CGRP基因。第2周末,除对照组外,其余大鼠腹腔注射STZ(50mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。每周测定大鼠甩尾反射潜伏期,比较其随病程的变化情况。第10周末,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测CGRP在缺血区心肌组织、脊髓及背根神经节转录水平。使用荧光显微镜观察eGFP表达情况。其余实验同第一部分。3、蛛网膜下腔CGRP基因转导对糖尿病大鼠心肌I/R损伤的实验研究。实验分为5组:对照(Control)组、糖尿病(DM)组、DM蛛网膜下腔注射手术(Sham)组、DM蛛网膜下腔注射对照(SC)组、DM蛛网膜下腔转导(SE)组。第1周末,水合氯醛腹腔麻醉下,经枕骨大孔途径蛛网膜下腔置管,转导CGRP基因。喂养条件、实验周期、后续实验同第二部分。结果:1、DM组糖尿病病程历时8周,体重显著低于Control组(P<0.01);腹腔注射STZ4周后,DM组甩尾反射潜伏期自第5周起显著长于Control组(P<0.05);与Control组相比,心肌经I/R后,DM组大鼠HR、LVSP、左室+d P/dtmax、左室-dP/dtmax均显著下降(P<0.05),LVEDP显著升高(P<0.05);DM组心肌梗死面积百分比(IS/AAR%)显著大于Control组(P<0.01);缺血区心肌组织(P<0.01)、血清(P<0.01)、1~5胸段脊髓(P<0.05)、1~5胸段背根神经节(DRG)(P<0.05)内CGRP的表达显著低于Control组。2、经心肌点注射法转导CGRP基因,与Sham组比较,ME组HR、LVSP、+dP/dtmax、左室-dP/dtmax显著上升(P<0.05),LVEDP显著降低(P<0.05);比较IS/AAR%,ME组高于Control组但低于DM、Sham、MC组,差异有统计学意义(P<0.05);与Control组比较,DM、Sham、MC组缺血区心肌组织、1~5胸段脊髓、1~5胸段DRG、1~5腰段DRG中CGRP转录水平明显下降(P<0.05),ME组缺血区心肌组织、1~5胸段DRG中CGRP转录水平明显上升(P<0.05);与DM、Sham、MC组比较,ME组1~5胸段脊髓CGRP转录水平明显上升(P<0.05);与DM、Sham、MC组比较,Control组、ME组大鼠缺血区心肌组织(P<0.01)、血清(P<0.01)、1~5胸段脊髓(P<0.05)、1~5胸段DRG(P<0.05)内CGRP明显较高,其中ME组心肌缺血区CGRP表达水平高于Control组(P<0.05),1~5胸段脊髓CGRP表达水平低于Control组(P<0.05)。3、经蛛网膜下腔注射法转导CGRP基因,与Control组比较,其余4组糖尿病大鼠甩尾反射潜伏期显著延长(P<0.01),其中与Sham组比较,SE组大鼠糖尿病第5~6周甩尾反射潜伏期较短(P<0.05);与Sham组比较,SE组HR、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmax、LVEDP差异无统计学意义(P>0.05);比较IS/AAR%,SE组与Sham组差异无统计学意义(P>0.05);SE组缺血区心肌组织中CGRP转录水平低于Control组(P<0.05)而高于Sham组(P>0.05),1~5胸段DRG、1~5腰段DRG中CGRP转录水平明显高于Sham组(P<0.05);与DM、Sham、SC组比较,Control组(P<0.01)、SE组(P<0.05)血清内CGRP含量明显较高,SE组1~5腰段DRG内CGRP含量高于其余4组(P<0.05)。结论:1、腹腔注射STZ可有效建立糖尿病大鼠模型,同时随病程延长,糖尿病大鼠发生感觉神经病变,热痛阈升高;2、与正常大鼠相比,糖尿病感觉神经病变大鼠心肌I/R期间心功能损害更为严重,对I/R损伤更敏感,内源性CGRP明显减少;3、心肌点注射转导CGRP基因可有效减轻糖尿病大鼠心脏I/R期间心功能损害,可减轻糖尿病大鼠心脏I/R损伤,可能与缺血区心肌及DRG中外源性CGRP表达上调有关;4、蛛网膜下腔注射转导CGRP基因可能在一定程度上延缓糖尿病感觉神经病变及热痛阈升高,可能与DRG外源性CGRP表达上调有关,但不能改变糖尿病感觉神经病变的病程,不能减轻糖尿病大鼠心脏I/R期间心功能损害及I/R损伤。