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近年来众多以蛋白激酶为靶点的药物进入临床和临床前研究,其出众的安全性和有效性受到越来越多的关注。其中,细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）是一类十分有潜力的抗肿瘤治疗靶点。选择性CDK4/6抑制剂帕博西林（Palbociclib）、瑞博西林（Ribociclib）和玻玛西林（Abemaciclib）先后被批准用于治疗乳腺癌,虽然取得了令人鼓舞的疗效,但是其频繁发生的不良反应和短期使用即会产生耐药性的缺陷显著降低了它们的临床收益。有研究表明,其不良反应主要归因于对正常细胞CDK4/6的过度抑制,同时CDK9的过度表达对CDK4/6抑制剂耐药性的产生有重要影响。因此,我们提出开发CDK6/9双重抑制剂来克服CDK4/6抑制剂的临床耐药性并提高疗效这一研发策略。目前,尚无有效的CDK6/9抑制剂被报道出来。在本研究中,我们通过基于靶点活性口袋结构的药物设计策略,设计和合成了一批小分子化合物,尝试开发一类具有良好抗肿瘤活性和成药性的CDK6/9双重抑制剂,并深入、系统地研究该类抑制剂的构效关系,同时验证这一类化合物的靶向性并阐明作用机理,综合探讨多靶点抑制剂在抗肿瘤药物开发中的经验和前景。我们在课题组自有化合物库中通过预筛选发现了一种具有CDK6和CDK9双重抑制活性的小分子化合物,苗头化合物8,它具有5-氯-嘧啶-2,4-二胺结构并且对CDK6/9的激酶抑制IC50分别为6.65和3.43μM,同时具有一定的抑制肿瘤细胞增殖的能力(IC50=38.6～56.2μM)。从苗头化合物8开始,我们通过对比分析靶蛋白结合口袋区域氨基酸残基和苗头小分子化合物之间的残基相互作用确定改造方向,借助计算机辅助药物设计进行化合物的设计和优化。并确定了以激酶抑制活性指导优化改造的方向,以抗肿瘤活性评价化合物的疗效的优化的原则,同时进行CDK6/9激酶抑制活性测试和抗肿瘤活性筛选,通过逐步优化开发符合设计预期的CDK6/9双重抑制剂。开发中为了同时兼顾小分子的选择性、安全性和有效性,我们在激酶活性筛选中引入了CDK2激酶活性测试来评价并改善选择性,引入L02细胞增殖测试来评价化合物对正常细胞的毒性。通过逐步优化和构效关系分析,最终获得了一个符合设计预期的5-氯-嘧啶-2,4-二胺类小分子抑制剂—化合物66,它表现出良好的抗肿瘤活性并能够平衡双靶点抑制效力。其对CDK6和CDK9的激酶抑制效力可达40 n M,体外抗肿瘤活性提高到4.01～8.08μM,同时对其他CDK家族蛋白具有选择性。为了明确化合物66与目标靶蛋白的相互作用,我们进行了靶向性验证。首先我们构建了目标靶蛋白的重组质粒并通过Hek293T蛋白表达系统成功表达并纯化出了具有生理活性的CDK6和CDK9重组蛋白,将化合物66和相应的活性重组蛋白共孵育一段时间后,通过细胞热转变分析和微量热涌动分析表征小分子化合物和目标靶蛋白之间直接的相互作用。靶向性研究表明,化合物66与CDK6、CDK9都有较强的亲和力,并且可以提高他们的热稳定性,这证明了小分子66与目标靶蛋白CDK6/9都具有直接的小分子-蛋白相互作用。另外,我们还对优选出的小分子化合物进行了更深入的作用机制研究,包括对细胞周期、细胞凋亡和活性氧水平等细胞生理的研究并阐明其对下游信号通路的调控作用。作用机制研究表明,化合物66能显著抑制CDK6和CDK9的蛋白功能,并通过调控下游信号通路影响细胞DNA损伤修复、细胞周期和细胞凋亡等关键细胞生理进程,最终杀死肿瘤细胞。为进一步研究目标小分子化合物的理化性质和成药性,我们测试了化合物的水溶性、脂水分配系数、肝细胞代谢稳定性和CYP抑制能力等性质,结果显示化合物66的水溶性一般,但是其盐酸盐水溶性较好,脂水分配系数为1.23,这些理化性质表明其适宜口服给药并符合里宾斯基五规则。肝细胞代谢稳定性测试和CYP抑制测试表明化合物66具有可接受的代谢稳定性,并且没有明显的CYP抑制效应,但是在小鼠和人之间的代谢情况存在明显的差异性,在小鼠体内代谢更快。为了测试化合物66的体内活性,我们通过动物模型进一步研究化合物的安全性、药代动力学特征和体内药效,其中药代动力学测试使用SD大鼠,检测其在大鼠体内的残留率并计算半衰期、驻留时间和生物利用度等性质,测试目标化合物在ICR小鼠上的半数致死量以评估其毒性,体内药效实验使用MDA-MB-231乳腺癌细胞的裸鼠荷瘤模型,测试化合物对肿瘤生长的抑制能力,评价体内药效。药物代谢动力学测试显示,化合物66在SD大鼠体内的口服半衰期为3.24小时,平均驻留时间为5.08小时,属中等水平,但其生物利用度不高,仅为28.9%,有待进一步改善。化合物的毒性试验结果表明化合物66的体内外毒性都较低,在L02细胞上的抗增殖IC50大于100μM,在ICR小鼠上的LD50大于500 mg/kg,在给药剂量下安全性较好,同时在裸鼠荷瘤实验中的抑瘤率（和对照组相比）达到79.4%,抗肿瘤效果十分优越。这些结果表明,化合物66体外对多种肿瘤细胞有较强抗肿瘤活性,体内也能有效抑制三阴性乳腺癌肿瘤组织的生长,同时成药性较好并可以通过口服给药,是一个十分有潜力的抗肿瘤小分子化合物。总的来说,本研究基于对CDK6和CDK9蛋白结构及生理功能的调研和分析,结合近期的关于CDK6和CDK9在生理上具有相关性的一些报道,设计合成了一系列5-氯-嘧啶-2,4-二胺衍生物,通过多角度的筛选和评价逐步优化化合物结构,最终发现了符合设计初衷的小分子化合物66并确证为CDK6/9双重抑制剂。它具有良好的体内外抗肿瘤活性,较好的安全性和可以接受的成药性,是一个十分具有潜力的CDK6/9双重抑制剂。这对丰富针对蛋白激酶抑制剂的小分子研发策略以获得更优的抗肿瘤小分子具有十分重要的意义。