血吸虫病是一种世界性的传染性疾病,它危害着人类的生命健康,阻碍社会发展。血吸虫DNA疫苗是预防血吸虫疾病的一种新方法,日本血吸虫的DNA疫苗的研究取得了很大的进展。本文克隆了日本血吸虫的抗原基因;对抗原基因进行基因融合;构建日本血吸虫DNA疫苗;研究了日本血吸虫DNA疫苗的发酵工艺,分离纯化工艺;研究了日本血吸虫DNA疫苗在体内、体外表达的可行性。主要取得以下成果:1)克隆了四种日本血吸虫抗原基因sj23、sjFABP、sjGAPDH、sj26,经过酶切、测序验证阳性克隆子;2)采用融合PCR实验技术,构建了两个融合基因sj23.FABP和sj26.GAPDH;3)亚克隆四种日本血吸虫抗原基因sj23、sjFABP、sjGAPDH、sj26和两种日本血吸虫抗原基因的融合基因sj23.FABP、sj26.GAPDH,插入到真核表达载体pVIVO2的多克隆位点,构建了14种日本血吸虫DNA疫苗;4)优化了日本血吸虫DNA疫苗的发酵条件:利用单因子实验,从5种碳源、6种氮源中最优碳源为甘油,最优氮源为豆饼汁;最佳K2HPO4添加比例为20%;通过“Plackeet-Burman”实验从6种发酵培养基的成份中筛选出3种重要影响因子:豆饼汁,牛肉汁,甘油。通过“Box-Behnken”分析,获得最佳培养基配方(m/v):NaCl 1%,YE 1%,磷酸盐0.3%(其中K2PO4添加比例为20%),甘油1.68%,牛肉汁2.28%,豆饼汁4.21%,初始pH值为7.0;5)建立了日本血吸虫DNA疫苗的制备工艺:采用凝胶过滤去除RNA和杂蛋白,采用亲和离子层析去除开环质粒DNA,采用亲和吸附去除内毒素。最终产品经过质量评价,在琼脂糖凝胶电泳图谱中不可见RNA条带,杂蛋白质质量分数占0.11%,超螺旋质粒DNA含量达93.4%,总热源含量为0.85EU/(mg plasmid)。各项指标都达到了国家食品药品监督管理局对医用级DNA疫苗的技术要求。6)通过间接荧光免疫检测,发现14种日本血吸虫DNA疫苗都分别能够在小鼠肌肉和MCF-7真核细胞中在抗原水平,成功表达。