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本研究以体外培养的人成骨肉瘤细胞系—MG63细胞为对象,应用有限稀释法进行单细胞分离和单克隆细胞株的培养,成功建立MG63骨肉瘤单克隆细胞株20余个。根据细胞形成的克隆形态,选取其中的完全克隆进行ALP、OCN、OPN等一系列成骨分化标志物基因表达的检测,同时检测各组细胞生物学行为指标,包括肿瘤细胞成瘤、侵袭、迁移、铺展粘附等,发现具有高低不同转移能力和成瘤能力的单克隆细胞株之间在部分成骨细胞标志物、肿瘤转移及促血管形成因子等基因表达具有显著差异。说明检测骨肉瘤细胞成骨分化标志物的基因表达差异可以判断肿瘤的分化程度。进一步通过RT-PCR、RealTime-PCR及Western blot等方法对它们的侵袭能力进行检测,发现高低不同转移能力的细胞株的Cofilin、Limk1基因及蛋白表达存在显著差异,说明Cofilin介导的信号通路在人成骨肉瘤细胞的侵袭、转移等行为中发挥极为重要的作用。最后本实验选取集落形成能力最强的Holoclone细胞株,利用无血清悬浮成球的方式分离出类肿瘤干细胞亚系---MG63-M,并在无血清培养环境中加入低浓度长春新碱,进一步富集、纯化。经RT-PCR、免疫荧光及流式细胞术等检测发现其表达CD133、Oct4、nestin等干细胞表面标志物,同时高表达Mdr1、ABCG2等多药耐药基因。另外,体外实验和动物实验都表明MG63-M不但具有与正常干细胞相似的自我更新和多项分化能力,同时具有极强的致瘤能力和极为显著的多药耐药性。本实验进一步验证了骨肉瘤异质性学说和肿瘤干细胞学说,为早期判断骨肉瘤侵袭及转移能力,克服骨肉瘤的多药耐药提供了新的理论基础和实验依据。