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研究背景和目的缺血性心脏病是由于冠状动脉的供血不足或中断,造成心脏能量不足,进而造成细胞凋亡或坏死,严重时将发展成心功能不全、心衰等。心肌细胞属终末分化细胞,几乎无再生能力,如果能在心肌缺血早期进行干预,可逆性地抑制心肌细胞凋亡,将会对缺血的心肌细胞起保护作用。Carabin是近年发现的TBC1蛋白家族的成员,可通过CaN和Ras信号通路防止心肌肥厚,对心脏起着保护作用。然而在心肌缺血的研究中,Carabin是否起着重要的作用尚无定论。我们前期实验结果发现人心室肌细胞AC16在氧糖剥夺(OGD)24h后Carabin的蛋白表达显著下调。Carabin是否与心肌细胞氧糖剥夺后的损伤相关联呢?我们拟建立氧糖剥夺诱导的AC16细胞凋亡模型,通过Carabin的过表达观察Carabin对氧糖剥夺诱导AC16细胞凋亡的影响,以期为缺血性心脏病的防治提供一些科学的理论依据。研究方法第一部分AC16细胞在氧糖剥夺诱导后的Carabin变化及慢病毒转染AC16细胞1.使用qRT-PCR和Western Blot实验方法,检测AC16细胞在氧糖剥夺诱导后Carabin的mRNA和蛋白表达情况。2.构建Carabin过表达慢病毒载体。3.慢病毒转染AC16细胞。第二部分Carabin过表达减轻氧糖剥夺诱导后AC16细胞的凋亡1.使用倒置显微镜观察AC16细胞在常氧或OGD 24h后的细胞形态情况。2.使用流式细胞术检测AC16细胞在常氧或OGD 24h后的细胞凋亡情况。3.使用TUNEL法检测AC16细胞在常氧或OGD 24h后细胞凋亡情况。4.使用Caspase-3检测试剂盒检测AC16细胞在常氧或OGD 24h后Caspase-3活性情况。5.使用乳酸脱氢酶活性检测试剂盒检测AC16细胞在常氧或OGD 24h后乳酸脱氢酶(LDH)活性情况。6.使用Western Blot法检测AC16细胞在常氧或OGD 24h后Caspase-3蛋白表达情况。第三部分Carabin过表达提高AC16细胞线粒体代谢功能1.通过线粒体压力实验检测常氧条件下AC16细胞的线粒体代谢功能情况。2.使用Western Blot法检测AC16细胞在常氧或OGD 24h后COX IV蛋白表达情况。3.使用COX IV活性测定试剂盒检测AC16细胞在常氧或OGD 24h后COX IV活性情况。研究结果第一部分AC16细胞在氧糖剥夺诱导后,Carabin的mRNA和蛋白变化明显。1.通过qRT-PCR和Western Blot实验结果显示:AC16细胞在氧糖剥夺诱导后,Carabin的mRNA和蛋白水平均降低(p<0.05)。2.慢病毒成功转染AC16细胞。通过qRT-PCR和Western Blot实验结果显示:转染后的AC16细胞Carabin持续高表达(p<0.05)。第二部分Carabin过表达减轻氧糖剥夺诱导后AC16细胞的凋亡1.倒置显微镜下观察细胞形态结果显示:空载常氧组及过表达常氧组的细胞生长状态良好,均匀铺满培养皿,细胞形态完整,大小均匀,贴壁牢固,边界清楚,呈梭形或者多边形。空载OGD 24h组与空载常氧组及过表达常氧组相比,细胞的生长状态很差,仅少部分细胞贴壁,大多数呈圆形漂浮状,细胞形态不完整,大小不均匀。过表达OGD 24h组与空载常氧组及过表达常氧组相比,细胞生长状态较差,细胞密度较低,细胞大小不均匀,大部分细胞呈梭形;但其与空载OGD 24h组相比,细胞的生长状态较好,细胞融合度稍高,仅少数细胞呈圆形漂浮状。2.流式细胞术检测细胞凋亡结果显示:空载OGD 24h组和过表达OGD 24h组与空载常氧组相比,凋亡率均升高(p<0.01),存活率均降低(p<0.01);然而,过表达OGD 24h组与空载OGD 24h相比,凋亡率明显降低(p<0.01),存活率明显升高(p<0.01)。3.TUNEL法检测细胞凋亡结果显示:空载OGD 24h组和过表达OGD 24h组与空载常氧组相比,凋亡数目均增多;过表达OGD 24h组与空载OGD 24h相比,凋亡数目减少(p<0.05)。4.Caspase-3活性检测结果显示:空载OGD 24h组与空载常氧组相比,Caspase-3活性明显增高(p<0.01);过表达OGD 24h组与空载OGD 24h相比,Caspase-3活性显著降低(p<0.05)。5.乳酸脱氢酶(LDH)活性检测结果显示:空载OGD 24h组与空载常氧组相比,LDH明显升高(p<0.0001);过表达OGD 24h组与空载OGD 24h相比,LDH明显降低(p<0.001)。6.Western Blot法检测AC16细胞Caspase-3的蛋白结果显示:空载OGD 24h组中的Caspase-3蛋白表达明显高于空载常氧组(p<0.05);过表达OGD 24h组中的Caspase-3蛋白表达低于空载OGD 24h组,差异有统计学意义(p<0.05)。第三部分Carabin过表达提高AC16细胞线粒体代谢功能1.线粒体压力实验结果显示:常氧培养条件下,Carabin过表达组与空载组AC16细胞相比,其线粒体的基础氧耗速率升高(p<0.05)、最大氧耗速率升高(p<0.05)、氧储备能力升高(p<0.05)和ATP生成水平明显升高(p<0.05)。2.使用Western Blot法检测COX IV蛋白结果显示:常氧培养条件下,过表达组与空载组AC16细胞的COX IV蛋白表达没有明显差异(p>0.05)。氧糖剥夺诱导24h后,过表达组与空载组AC16细胞的COX IV蛋白表达也无明显差异(p>0.05)。但是,空载组细胞在OGD 24h后COX IV蛋白明显比常氧培养条件下降低(p<0.05);过表达组细胞在OGD 24h后COX IV蛋白也明显比常氧培养条件下降低(p<0.05)。3.COX IV活性检测结果显示:常氧培养条件下,过表达常氧组的COX IV活性明显高于空载常氧组(p<0.05);OGD 24h后,过表达OGD 24h组的COX IV活性明显高于空载OGD 24h组(p<0.05)。空载组细胞在OGD 24h后的COX IV活性比常氧培养条件下明显降低(p<0.05);过表达组细胞在OGD 24h后的COX IV活性也比常氧培养条件下降低(p<0.05)。研究结论Carabin过表达提高AC16细胞线粒体代谢功能,进而减轻氧糖剥夺诱导AC16细胞的凋亡。