研究背景：子宫颈癌是全世界女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一,发病率仅次于乳腺癌而位居第二位,死亡率为第五位,严重威胁人类生命和健康。据统计,全世界每年大约有50万新发子宫颈癌病例,占所有癌症新发病例的5%；近27万患者死亡。我国每年新发病例13-15万,大约占全球发病总数的三分之一；我国每年子宫颈癌死亡人数大约为5万。子宫颈癌的主要病理类型有鳞状上皮癌和腺上皮癌,其进展是一个相当复杂的过程,与多基因多阶段的异常调控有关,目前我们对子宫颈癌发生发展机制的了解仍不全面。研究已证实,高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是子宫颈癌明确的致病原因。然而,感染HPV的女性并不一定发展成为子宫颈癌；此外,并不是所有处于子宫颈上皮癌变的患者最终均能发展成为子宫颈浸润癌。这说明子宫颈癌的发生发展是个复杂的过程,除了人类HPV病毒之外,还有其他因素在子宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。因此,子宫颈癌发病和进展的分子机制仍需深入研究。MicroRNAs (miRNAs)是由20-25个核苷酸组成的RNA,通过与靶基因的3’非翻译区(3’-UTR)结合进而促进mRNA降解或者抑制mRNA翻译而发挥作用。通过在转录后水平调控基因表达,miRNAs在很多生命活动中发挥其重要功能,包括细胞增殖、分化、凋亡、发育等。已有研究报道,miRNAs表达异常与许多疾病如糖尿病、心血管疾病、类风湿关节炎等的发病及进展有密切相关性。近年来研究表明, miRNAs在人类许多癌症中也发挥重要作用,参与了肿瘤的发生、发展以及转移等多个过程。研究发现,有些miRNAs发挥癌基因作用,另外一些miRNAs发挥抑癌基因作用。miRNAs与其调节的靶基因形成调控网络共同调节肿瘤的发生及发展。研究还证实,miRNAs在癌症患者血清及癌组织中表达异常与肿瘤的发病、进展、转移、侵袭及耐药有密切的关系,因此miRNAs可能成为肿瘤诊断的良好靶标分子。MicroRNA-195 (miR-195)是一重要的抑癌miRNA,在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中均发挥抑癌基因的作用。然而,miR-195在子宫颈癌中的作用尚不完全清楚。为明确miR-195在子宫颈癌发生发展中的作用,本学位论文第一部分首先从临床样本出发,检测miR-195在子宫颈癌组织及癌旁组织中的表达情况,分析其表达与子宫颈癌发生、发展、转移的相关关系。结果提示miR-195在子宫颈癌中可能发挥抑癌基因作用。肿瘤细胞的增殖和转移是子宫颈癌发生发展的关键环节。肿瘤细胞的增殖与肿瘤的生长密切相关,而肿瘤细胞的侵袭、迁移能力决定了其转移能力。为进一步明确miR-195对子宫颈癌发病的抑制作用,本学位论文第二部分在体外培养的子宫颈癌细胞(HeLa)中表达miR-195,检测miR-195对细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。在确定miR-195能抑制HeLa细胞增殖、侵袭及迁移能力的基础上,本学位论文第三部分深入研究了miR-195发挥作用的分子机制,筛选并鉴定了细胞周期蛋白D2 (CyclinD2, CCND2)和转录因子MYB为miR-195直接调控的靶基因。细胞增殖与细胞周期密切相关,而CCND2是一重要的细胞周期蛋白。CCND2通过与周期蛋白依赖的激酶4(CDK4)及周期蛋白依赖的激酶6(CDK6)结合,进而调节CDK4和CDK6的活性,从而促进细胞从G1期转化至S期。研究表明,CCND2异常表达与人脑组织胶质瘤、胃癌等多种肿瘤的发生具有密切相关性。MYB是广泛存在的转录因子,它可以通过调节基因表达从而在细胞的分化与增殖过程中起到重要作用。MYB在神经母细胞瘤及乳腺癌等多种肿瘤组织中呈现高表达状态,并且其表达水平与预后密切相关。此外还有研究表明,MYB蛋白和肿瘤侵袭及转移密切相关。可见,CCND2和MYB是两个重要的促肿瘤蛋白。我们第三部分实验结果显示,miR-195可作用于CCND2及MYB基因的3’-UTR而直接抑制蛋白质表达,该结果初步阐明了miR-195抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、侵袭及迁移的分子机制。本论文的基本框架和主要研究内容如图1所示,各部分的详细研究思路和技术路线将在论文中作进一步的阐述。第一部分：miR-195在子宫颈癌组织中的表达研究目的：检测子宫颈癌组织及癌旁组织中miR-195的表达情况,并结合临床病理资料分析miR-195与子宫颈癌发生、转移的关系。方法：在本部分研究中,我们首先收集69对子宫颈癌的临床样本,并提取子宫颈癌组织和对应癌旁组织的RNA,然后利用实时荧光定量PCR技术对miR-195表达水平进行检测,明确miR-195在子宫颈癌组织及邻近癌旁组织中的表达情况。最后,分析miR-195表达与子宫颈癌发病的相关性；进一步结合临床病理资料分析miR-195表达与子宫颈癌转移的相关性。结果：1.相对于癌旁组织,miR-195在子宫颈癌组织中的表达明显下调,统计分析结果显示差异具有显著性。2.与没有发生转移的子宫颈癌样本(38例)相比,miR-195在发生转移的子宫颈癌样本(31例)中表达显著下调(降为0.43倍)。3.在没有发生淋巴结转移的子宫颈癌病例中,18例(47%)肿瘤组织中miR-195表达水平较癌旁组织降低,8例(21%)肿瘤组织中miR-195表达水平较癌旁组织未发生改变,12例(32%)肿瘤组织中miR-195表达水平较癌旁组织升高。在发生淋巴结转移的病例中,20例(65%)肿瘤组织中miR-195表达水平较癌旁组织降低,6例(19%)肿瘤组织,中miR-195表达水平较癌旁组织未发生改变,5例(16%)肿瘤组织中miR-195表达水平较癌旁组织升高。结论：1.相对于癌旁组织,miR-195在子宫颈癌组织中的表达明显下调,说明miR-195在子宫颈癌中可能作为抑癌基因发挥作用。2.相对于未发生盆腔淋巴结转移的子宫颈癌样本,miR-195在发生转移的子宫颈癌样本中表达显著下调,说明miR-195在子宫颈癌的发展过程中可能发挥了重要的作用。第二部分：miR-195对子宫颈癌细胞(HeLa)增殖、迁移及侵袭能力的影响目的：体外细胞模型研究miR-195对子宫颈癌细胞(HeLa)增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法：在本部分研究中,我们在HeLa细胞中高表达miR-195,通过对细胞进行直接计数,从而明确miR-195对HeLa细胞增殖的影响。利用流式细胞术检测HeLa细胞中表达miR-195后细胞周期的改变,从而明确miR-195对HeLa细胞周期的影响。利用伤口愈合模型来研究miR-195对HeLa细胞迁移能力的影响。利用基于Matrigel的Transwell法研究miR-195对HeLa细胞侵袭能力的影响。结果：1.miR-195对HeLa细胞增殖的影响第5天假转染组(Mock)细胞数为(14.5±2.1)×105；对照组细胞数为(14.6±0.8)×105；而表达miR-195组细胞数为(10.4±1.0)×105,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。CCK-8检测结果显示,与Mock组相比,转染对照RNA对活力细胞数无影响(0.97±0.11倍),而高表达miR-195组细胞生长较对照组比较显著降低(0.69±0.08倍),两者比较差异有显著性(P<0.05)。2.miR-195对HeLa细胞周期的影响Mock组中处于G0/G1期的细胞占总细胞数的50%,S期细胞约占39%；G2/M期细胞约占11%；对照组中处于G0/G1期的细胞占总细胞数的49%,S期细胞约占41%；G2/M期细胞约占10%；高表达miR-195后,处于G0/G1期的细胞比例增加(60%)；处于S期的细胞比例减少(30%)。三次实验结果统计显示,表达miR-195组G0/G1期细胞比例较对照组显著增加(P<0.05),而S期细胞比例较对照组显著减少(P<0.05)。3.miR-195对子宫颈癌HeLa细胞伤口愈合能力的影响与对照组相比,高表达miR-195的HeLa细胞伤口愈合能力显著下降。4.miR-195对子宫颈癌HeLa细胞侵袭能力的影响细胞接种24小时后,miR-195高表达组迁移穿过Matrigel的细胞数明显少于对照组；结晶紫染色结果显示,miR-195高表达组迁移穿过Matrigel的细胞染色吸光值为对照组的0.69±0.06倍(P<0.05)。结论：1.miR-195在子宫颈癌中可能作为抑癌基因发挥作用,可抑制HeLa细胞生长、增殖、迁移和侵袭。2.miR-195可作为子宫颈癌治疗的潜在靶点,为子宫颈癌的治疗提供新的思路。第三部分：miR-195功能靶基因CCND2和MYB的鉴定目的：预测并验证miR-195在HeLa细胞中的靶向基因,从而明确miR-195调控子宫颈癌细胞行为的作用机制。方法：本部分研究中,我们选择较为权威的生物信息学工具TargetScan、DIANA microT和PicTar对miR-195的靶基因进行预测,得到一批共同预测到的靶基因。经过功能注释以及文献检索,最终将目标锁定在CCND2和MYB两个基因上。进一步利用定量PCR、蛋白质免疫印迹等方法来验证miR-195对CCND2口MYB表达的调控作用；并将包含有miR-195结合区的CCND2和MYB基因的3’-UTR序列构建到荧光素酶报告质粒中,然后将该质粒与miR-195共同转染到HeLa细胞中进行双荧光素酶活性检测。最后,在高表达miR-195的细胞中回补CCND2和MYB,检测细胞增殖、迁移及侵袭能力。结果：1.经过生物信息学预测及功能注释和文献检索,最终将目标锁定在CCND2和MYB两个基因上。其中CCND2与细胞周期密切相关,而MYB与肿瘤细胞转移、侵袭有密切相关性。2.定量PCR实验结果显示,在HeLa细胞中高表达miR-195后,CCND2基因的mRNA水平下降至对照组的0.85±0.07倍(P<0.05),MYB基因的mRNA水平下降至对照组的0.79±0.06倍(P<0.05)。蛋白质免疫印迹结果显示,高表达miR-195后CCND2和MYB的蛋白水平也显著降低。以上结果表明,miR-195在HeLa细胞中抑制CCND2和MYB基因的mRNA及蛋白质表达。荧光素酶检测结果显示,含CCND2基因3’-UTR的报告系统中,高表达miR-195组荧光素酶活性降低为对照组的0.65±0.07倍(P<0.05)；含MYB基因3’-UTR的报告系统中,高表达miR-195组荧光素酶活性降低为对照组的0.53±0.08倍(P<0.05)。3.在高表达miR-195的细胞中回补CCND2可以使细胞增殖能力回复到对照组的0.85±0.07倍,与转染miR-195组(为对照组的0.65±0.07倍)相比差异有显著性,回补CCND2对miR-195抑制的细胞迁移、侵袭能力无影响。4.在高表达miR-195的细胞中回补MYB可以使细胞增殖能力回复到对照组的0.77±0.05倍,与转染miR-195组(为对照组的0.65±0.07倍)相比差异有显著性；回补MYB使miR-195抑制的细胞迁移得以部分回复；回补MYB可以将被miR-195抑制的细胞侵袭能力回复到对照组的0.86±0.07倍,与转染miR-195组(为对照组的0.69±0.05倍)相比差异有显著性。结论：1.在子宫颈癌细胞中,miR-195可以直接与CCND2及MYB基因的3’-UTR区结合,从而抑制二者的表达。2.miR-195可以直接抑制CCND2和MYB基因的表达,从而发挥其抑制子宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。