食品中林可酰胺类抗生素和黄曲霉毒素残留的酶联免疫分析方法研究

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克林霉素(Clindamycin,CLIN)和林可霉素(Lincomycin,LIN)经常作为兽药而残留在动物源性食品中,黄曲霉素在绝大多数坚果类、粮油类里都有检出。CLIN和LIN的残留不仅可能导致恶心、注射部位疼痛等,也可能升高患伪膜性肠癌的风险。黄曲霉素B1(Aflatoxins B1,AFB1)是黄曲霉素中毒性最强也是经常被检出的代表之一,具有强烈的致癌作用。本研究主要内容如下:1、CLIN单克隆抗体的制备:以琥珀酸酐法、活化酯法和高碘酸钠还原法制备CLIN和LIN免疫原和包被原,经质谱检测计算偶联比率为3.9至6.7。使用免疫原CLIN-BSA免疫小鼠后,检测小鼠均产生了特异性抗体。选取抗血清灵敏度和效价最高的鼠,成功制备了能稳定分泌单克隆抗体的细胞株3B9。基于3B9制备的单克隆抗体,建立间接竞争ELISA方法。该方法的抗体亚型为IgG1,轻链亚型为λ型,工作浓度为0.096μg/mL,包被抗原工作浓度为0.12μg/m L,此时测得的ODmax为1.795,CLIN的IC50为1.2 ng/m L。该抗体对LIN有较明显的交叉反应,交叉反应率为25%,IC50为5.8 ng/mL。2、建立了检测牛肉、鸡肉、猪肉、鱼肉中CLIN和LIN残留的间接竞争ELISA方法:以上述单克隆抗体为基础,用LIN-OVA作为包被原包被酶标板,建立异源性间接竞争ELISA方法,并对影响ELISA方法工作性能的因素进行优化。在最适宜条件下,检测CLIN和LIN的ELISA方法的标准曲线的IC50值分别为0.3ng/mL(CLIN)和1.2 ng/mL(LIN)。优化建立了一个简单的样品前处理方法,10分钟内基质效应基本消除,可检测牛肉、鸡肉、猪肉、鱼肉中CLIN和LIN残留。该ELISA方法检测上述食品基质的检测限分别为1.8μg/kg(CLIN)和6.8μg/kg(LIN)。在添加回收试验中,在不同的添加水平范围内,平均回收率从76%到112%不等,批内/批间变异系数在7.1%到13.2%之间,均不超过15%。该ELISA方法经国家标准LC-MS/MS方法验证,相关系数R2为0.9653,符合中国、欧盟和美国关于食品基质中CLIN和LIN残留检测的要求。3、建立了大米和米粉中AFB1残留的间接竞争ELISA方法针对南方地区广泛食用的大米、米粉等食品基质,优化建立了间接竞争ELISA方法。新建立的方法的特异性好,对AFB1有很好的识别水平,其IC50值为0.4 ng/mL,对其他种类真菌毒素的识别能力较弱,交叉反应率在1%以下。本研究优化建立了一种快速检测大米、米粉中AFB1残留的样品前处理法。该ELISA方法检测大米和米粉中AFB1残留的检测限为0.89μg/kg。在添加回收实验中,平均回收率范围为73.9%?102.7%,批内和批间的CV范围为5.16%?11.36%,均在可接受范围内。该方法经国家标准LC-MS/MS方法对比验证,相关系数R2为0.9943,证明该方法准确性满足中国、欧盟、美国对于食品基质中AFB1残留检测的要求。
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