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蓝舌病（Bluetongue disease，BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起，由库蠓传播的反刍动物病毒性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疫病。该病主要集中在各热带、亚热带和温带国家，给畜牧业造成巨大的损失。在蓝舌病病毒编码的各种蛋白质中，VP7蛋白为群特异性抗原。VP7蛋白是蓝舌病病毒主要的核心抗原，携带有群特异性抗原决定簇，能刺激被感染机体产生强的群特异性免疫反应。因此，VP7基因已成为BTV研究的热点。本研究在克隆并鉴定蓝舌病病毒VP7基因基础上，进行VP7蛋白的原核表达，并制备相应单克隆抗体，为诊断试剂研制奠定了基础。1．蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及纯化产物反应原性鉴定根据已发表BTV VP7基因序列，设计并合成一对引物。利用RT-PCR方法扩增BTV-5型毒株编码群特异性抗原的VP7基因片段。将扩增片段克隆至pGEM-T Easy载体中，构建VP7基因重组载体。经核苷酸序列测定，克隆的基因片段长1050bp，为S7基因开放性读码框的全长序列，编码349个氨基酸。将VP7基因片段连接至pET-DsbA、pET-GST和pET-His表达载体中，经抗性筛选、PCR扩增、限制性内切酶分析，筛选获得BTV VP7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆。阳性克隆质粒在E.coli BL21（DE3）pLysS感受态细胞中经IPTG诱导表达，筛选到高表达重组载体pET-DsbA／VP7。镍琼脂糖凝胶亲和层析分离重组载体pET-DsbA／VP7表达的带His标签的重组VP7蛋白。SDS-PAGE、Western blotting和ELISA实验表明，表达蛋白为融合蛋白，分子量约为63.2kDa，具有良好的群特异反应原性。2．蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体制备及鉴定本研究通过BHK-21接种，增殖蓝舌病病毒，将收获的病毒液用甲醛灭活。用纯化病毒免疫Balb／c小鼠，取免疫鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合。用ELISA试验筛选阳性株，采用有限稀释法对其进行克隆，经过融合共获得2株能稳定分泌抗BTV VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3E2和1C11。细胞培养上清ELISA效价分别为29和210，腹水ELISA效价可达4×106和16×106。所有单抗特异性良好，与鹿流行性出血热病毒、背景源蛋白无交叉反应。腹水中纯化的单抗3E2与不同BTV血清型的绵羊抗血清进行竞争ELISA反应，证实有良好的竞争抑制性。