基于转录组的中华相手蟹免疫相关基因研究

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中华相手蟹(Sesarmops sinensis)是一种杂食性底栖蟹类,隶属于甲壳纲、十足目、短尾下目、方蟹总科、相手蟹科。在我国,广泛分布于江浙沪等东南沿海地区的潮间带,生活在复杂的环境中,被用作环境变化和水污染的良好指标。由于近年来的环境退化和疾病的频繁暴发,中华相手蟹所处的生态环境遭到严重破坏,其死亡率不断上升,物种资源急剧下降。为了在保护其所处的生态环境的基础上促进沿海经济发展,为了预防疾病的发生,对中华相手蟹的免疫基因进行研究就显得非常重要。本研究基于高通量测序技术,对经磷酸缓冲盐溶液(PBS,Phosphate buffer saline)、肽聚糖(PGN,Peptidoglycan)、脂多糖(LPS,Lipopolysaccharides)处理的中华相手蟹肝胰腺组织分别进行转录组测序,对中华相手蟹肝胰腺组织在PGN和LPS感染下的差异表达基因进行分析,展示了中华相手蟹肝胰腺组织中与免疫相关的基因以及与免疫相关的代谢通路。主要得到结果如下:1.在经过PBS和PGN刺激后的中华相手蟹肝胰腺转录组中,两组样品分别获得45,491,736条和58,178,646条原始读长(Raw reads),44,414,140条和56,834,314条干净读长(Clean reads),共15.19 Gb。拼接组装后共获得85,556个转录本和39,039个unigene,平均长度分别为1,096 bp和1,105 bp,Q30的值均在91.40%及以上。2.在七大公共数据库中对拼接得到的unigene进行基因功能注释,最终在NR、NT、KEGG、Swiss Prot、Pfam、GO、KOG数据库中分别有12,825(32.85%)、3,729(9.55%)、6,603(16.91%)、9,602(24.59%)、13,661(34.99%)、13,661(34.99%)、5,749(14.72%)个unigene得到注释。在KOG数据库的5,749个unigene中,有42个unigene参与到V分类“防御机制”中。在KEGG数据库中,6,603个unigene分散到245条通路中。3.对标准化后的unigene进行差异表达分析,共有1,300个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)被筛选出来,其中466个差异基因上调,834个差异基因为下调基因。筛选13个免疫相关基因进行qRT-PCR分析,以肌动蛋白基因β-actin为内参基因。结果显示,这些基因都有着不同程度的上调,与转录组测序结果一致,表明转录组数据具有可信度和所筛选的基因在中华相手蟹面对外界刺激时参与免疫防御过程。4.在PBS对照组和LPS实验组中,两组样品分别得到原始读长(raw reads)有45,491,736条和55,303,248条,干净读长(clean reads)有44,418,190条和53,694,142条,GC含量分别为49.14%和49.87%。从头拼接组装后,共得到94,485个转录本和42,421个unigene,平均长度分别为1,124bp和1,098bp,总核苷酸数分别为106,225,673和46,577,934。5.在七大公共数据库对所获得的unigene进行功能注释,结果表明分别有13,843(32.63%)、4,189(9.87%)、6,995(16.48%)、10,415(24.55%)、14,765(34.80%)、14,765(34.80%)、6,048(14.25%)个unigene在NR、NT、KEGG、Swiss Prot、Pfam、GO、KOG数据库得到注释。其中,127个unigene被归类为“免疫系统过程”,2,183个unigene被注释为“对刺激的反应”。6,995个unigene被注释到KEGG数据库中的231条已知的代谢通路中,有266个unigene参与到“免疫系统”通路中。6.对unigene进行差异分析,共鉴定出1,950个差异表达基因,其中包括1,144个上调基因,806个显著下调基因。在KEGG富集分析结果中发现“肌动蛋白细胞骨架的调节”是差异表达基因富集最多的通路。以18S基因作为内参基因,从差异表达基因中选取8个免疫相关基因进行qRT-PCR分析,结果显示,这些基因都有着不同程度的上调,与转录组测序结果一致,表明所筛选的这些差异表达基因参与中华相手蟹的免疫防御反应。总之,本研究不仅丰富了中华相手蟹现有的转录组数据,而且还阐明了中华相手蟹应对外界(PGN和LPS)刺激时的免疫相关通路和免疫防御机制,这为接下来对中华相手蟹免疫功能基因进行探究提供了理论依据,有助于我们对甲壳动物的免疫防御机制作更深层次的理解。
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