脊髓损伤所致的神经功能障碍是全球性的医疗难题,损伤部位胶质瘢痕及抑制性微环境的产生是导致治疗困难的关键原因之一。14-3-3蛋白在中枢神经系统中含量极为丰富,被多项研究证实对脑神经元缺血缺氧损伤有保护作用。但其在脊髓组织中的研究和应用相对较少,脊髓损伤方面更是寥寥无几。有报道发现脊髓损伤早期14-3-3ε蛋白明显增高,而其在神经元缺血缺氧损伤后的活性并无明显变化。因而我们推测,脊髓损伤后早期14-3-3ε蛋白在脊髓中的高表达可能与星形胶质细胞的活化有关,14-3-3ε蛋白可能影响或参与星形胶质细胞在损伤早期的活化。我们通过体外原代培养星形胶质细胞以及大鼠脊髓损伤两部分实验,初步探查14-3-3ε蛋白在脊髓损伤活化星形胶质细胞中的表达变化,试图为脊髓损伤后抑制胶质瘢痕形成、促进神经功能恢复提供一个新的可供选择的思路和方向。第一部分14-3-3ε蛋白在损伤后原代培养活化星形胶质细胞中的表达目的：初探损伤后星形胶质细胞中表达14-3-3ε蛋白和GFAP水平的变化趋势和相关关系方法：原代培养新生SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞,建立体外缺糖缺氧/缺血-再灌注模型和机械划伤模型,通过免疫蛋白印迹和免疫荧光双标染色的方法,检测损伤后活化的星形胶质细胞表达活化标志物胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)和目的蛋白14-3-3ε随时间变化(4h、8h、12/16h、24h、48h、72h)的趋势和相关关系。结果一(体外缺糖缺氧/缺血-再灌注模型结果)：①.造模后目的蛋白14-3-3ε和星形胶质细胞活化标志物GFAP表达水平变化趋势的关系：损伤早期(缺糖缺氧4h),14-3-3ε蛋白和GFAP表达水平便开始明显增多,且持续高水平表达至损伤后期。两者不同的是,14-3-3ε的高峰时间先于GFAP出现,具体表现为：造模后GFAP的表达呈持续性增多的趋势,而14-3-3ε在造模后24h达到最高峰值,后期(48h)甚至稍有下降；②.造模后14-3-3ε和GFAP表达水平间的数量依存关系：在表达水平呈现上升趋势的造模后24小时内,14-3-3ε和GFAP的表达水平间存在具有统计学意义的线性相关关系(R2=0.3060,P=0.017)；造模后48h,由于14-3-3ε和GFAP变化趋势不同(14-3-3ε开始出现下降趋势,GFAP仍然呈持续性上升趋势),从而造成线性相关关系无统计学差异(R2=0.0996,P=0.133)；β造模后14-3-3ε和GFAP的表达定位关系：免疫荧光染色显示14-3-3ε和GFAP的表达有高度一致的亚细胞定位(胞质),且在表达强度上两者也具有高度的一致性：即14-3-3ε表达强的细胞内也有高表达强度的GFAP。结果二(体外机械划伤模型结果)：①.造模后14-3-3ε和GFAP表达水平变化趋势的关系：与缺糖缺氧/缺血-再灌注模型模型不同,机械划伤模型中的14-3-3ε蛋白变化趋势不明显,各时间点之间蛋白水平变化无统计学差异；但GFAP的升高趋势较为明显,尤其是在48h可检测到GFAP的显著性增多。②.造模后14-3-3ε和GFAP表达水平间的数量依存关系：线性相关分析结果显示14-3-3ε和GFAP的表达水平存在显著线性相关关系(R2=0.3119,P=0.009),线性回归系数为0.3646,证实了GFAP与14-3-3ε表达水平之间存在数量依存关系；p造模后14-3-3ε和GFAP的表达定位关系：免疫荧光染色同样显示14-3-3ε蛋白和GFAP在活化星形胶质细胞中良好的共定位,具体表现包括造模后14-3-3ε和GFAP均表达增强(较对照组)强度且同一时间点时,越靠近划痕14-3-3ε和GFAP表达强度越高。结论：目的蛋白14-3-3ε和星形胶质细胞活化标志物GFAP在损伤早期活化的星形胶质细胞中的表达增多,二者不仅表达变化趋势相似,表达水平间也存在显著的线性相关关系,并且在细胞中具有高度一致的亚细胞定位。因此,可以认为损伤早期星形胶质细胞内源性表达14-3-3ε蛋白与星形胶质细胞的活化有关,14-3-3ε蛋白可能通过星形胶质细胞活化从而在脊髓损伤中发挥相应的作用。第二部分14-3-3ε蛋白在SD大鼠脊髓损伤中的表达目的：了解14-3-3s蛋白和GFAP在脊髓损伤后的表达趋势及相关关系方法：利用Allen’s模型造成成年SD大鼠T10节段的脊髓损伤,在损伤后4h、8h、16h、24h、3d、7d、14d和28d分别快速冰上取材或灌流取材,获得以损伤处为中心的脊髓组织。通过免疫蛋白印迹和免疫荧光染色的方法,检测活化AS标志物GFAP和目的蛋白14-3-3ε的表达变化,探究二者的相关性。结果：①.脊髓损伤后14-3-3ε和GFAP表达水平变化趋势的关系：与体外缺糖缺氧/缺血-再灌注造模类似,GFAP和14-3-3ε蛋白的表达在脊髓损伤早期(4h或8h)便开始明显增多。14-3-3ε蛋白在SCI后最初的24小时呈现出较为显著的上升趋势,伤后7到28天的表达相对稳定；而GFAP的表达随着损伤时间的延长逐渐增加,且一直持续高表达至28d；两者相比,14-3-3ε的上升平台期先于GFAP出现。②.脊髓损伤后14-3-3ε和GFAP表达水平间的数量依存关系：线性相关分析显示14-3-3ε蛋白与GFAP的表达水平之间存在数量依存关系(线性回归系数=0.6478,R2=0.7100,P<0.001),证实了体内实验时GFAP与14-3-3ε表达水平之间也存在数量依存关系；p脊髓损伤后14-3-3ε和GFAP的表达定位关系：免疫荧光染色结果显示了14-3-3ε和GFAP在脊髓损伤后的脊髓组织中具有的良好的定位共性,包括造模组两者的表达强度明显高于假手术组的表达强度、14-3-3ε表达强的组织部位也有高表达强度的GFAP等。结论：SCI后14-3-3ε蛋白和GFAP表达在损伤周围的脊髓组织中明显增加,尽管14-3-3ε蛋白的变化先于GFAP达到平台期,但二者在表达水平仍然存在显著的线性相关关系、共同的变化趋势以及一致的组织定位。在体实验进一步证实了脊髓损伤后早期14-3-3s蛋白在脊髓中的高表达可能与星形胶质细胞的活化有关,其可能影响或参与星形胶质细胞在损伤早期的活化。