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目的:内毒素血症(endotoxemia)是一种发生在感染或损伤后的临床综合征,常引起患者多器官衰竭。内毒素血症进展中,巨噬细胞在机体应对细菌感染过程中发挥关键作用,但其过度的活化会释放大量促炎介质,导致组织损伤和器官功能障碍。适时的调控巨噬细胞活化是减少内毒素血症宿主机体损伤的潜在治疗策略。5’-AMP是细胞代谢过程中不可或缺的物质,可以转化为ATP及腺苷,并能激活AMPK。早期研究发现5’-AMP作为嘌呤能代谢的中间产物可以减轻内毒素血症引发的肝损伤,但具体机制仍不完全清楚。因此,本课题将在前期工作的基础上,进一步阐明5’-AMP调控巨噬细胞缓解内毒素血症的潜在分子机制。方法:(1)体内检测5’-AMP对内毒素血症的影响:将8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为LPS组和5’-AMP+LPS组,5’-AMP(0.5 mmol/kg,i.p.)预处理0.5 h后,致死剂量LPS(25 mg/kg,i.p.)处理观察小鼠生存曲线。LPS(15 mg/kg,i.p.)处理构建内毒素血症小鼠模型,12 h后干式生化仪检测小鼠血清ALT、AST、BUN,ELISA检测小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6,HE染色观察肝、肺组织损伤,q RT-PCR检测肝脏组织TNF-α、IL-1β、IL-6表达。(2)体外研究5’-AMP对腹腔巨噬细胞表型和功能的影响:分离小鼠腹腔巨噬细胞,将腹腔巨噬细胞分为三组control组、LPS(1μg/ml)组、5’-AMP(0.4 m M)+LPS组,流式检测CD86、MHCⅡ的表达。Western-blot检测i NOS和Arg-1的蛋白水平。q RT-PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-1RA等炎症相关基因的表达水平。(3)探索外源性5’-AMP调控巨噬细胞功能重塑的机制:高效液相色谱法(HPLC)检测5’-AMP处理腹腔巨噬细胞培养上清中腺苷的浓度。流式细胞术检测成年小鼠腹腔灌洗液细胞CD73的表达,免疫荧光检测腹腔巨噬细胞A2AR表达。将腹腔巨噬细胞分为五组control组、LPS组(LPS终浓度为1μg/ml)、5’-AMP+LPS组(5’-AMP终浓度为0.4 m M)、CD73抑制剂APCP+5’-AMP+LPS(APCP终浓度为100μM)组、A2AR抑制剂ZM241385+5’-AMP+LPS(ZM241385终浓度为1μM)组。ELISA检测巨噬细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-10水平,q RT-PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA水平。c AMP试剂盒检测巨噬细胞胞内c AMP浓度。将腹腔巨噬细胞分为6组control组、LPS组(LPS终浓度为1μg/ml)、5’-AMP+LPS组(5’-AMP终浓度为0.4 m M)、5’-AMP+PKA抑制剂H89+LPS组(H89终浓度为20μM)、c AMP类似物db-c AMP+LPS(db-c AMP终浓度为100μM)组、db-c AMP+H89+LPS组,Western-blot检测p-STAT1、p-STAT3、p-ERK、p-JNK。结果:(1)外源性5’-AMP显著改善内毒素血症小鼠生存率,缓解内毒素血症小鼠肝、肺组织损伤,降低小鼠血清ALT、AST、BUN的含量以及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。同时也降低小鼠肝脏组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。(2)5’-AMP降低巨噬细胞表面M1型标记CD86、MHCⅡ与胞内i NOS的表达,升高Arg-1的表达。q RT-PCR表明5’-AMP降低腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6,升高IL-10、IL-1RA的表达。ELISA也证实5’-AMP降低腹腔巨噬细胞培养上清TNF-α,升高IL-10水平。(3)HPLC显示5’-AMP升高腹腔巨噬细胞培养上清腺苷浓度。流式结果表明CD73在正常成年小鼠的腹腔细胞中主要表达于腹腔巨噬细胞。免疫荧光显示腹腔巨噬细胞表达腺苷受体A2AR。ELISA结果显示APCP和ZM241385能够拮抗5’-AMP的抑炎作用,升高TNF-α、IL-1β水平,降低IL-10水平。q RT-PCR技术进一步验证APCP和ZM241385的拮抗作用。5’-AMP显著升高腹腔巨噬细胞胞内c AMP浓度,下调STAT1的上游激酶p-ERK和p-JNK的蛋白水平,H89降低5’-AMP+LPS组pSTAT3水平。结论:(1)5’-AMP显著缓解内毒素血症引起的组织损伤并提高内毒素血症小鼠生存率,其机制与5’-AMP调控腹腔巨噬细胞功能重塑有关。(2)5’-AMP调控腹腔巨噬细胞功能重塑依赖于A2AR/c AMP/PKA/STAT3信号轴。