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研究背景:肺癌发病率高,死亡率高,严重威胁人类生命健康,在所有恶性肿瘤中,发病率、死亡率男性第一位,女性占第二位,是导致癌症相关死亡的最主要的原因之一,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占据肺癌患总数的80%,它包括肺腺癌和鳞状细胞癌。近20年以来,在该领域的研究不断取得进展,各种靶向治疗和免疫疗法的应用,不断延长肺癌患者的生存期。CSMD3(CUB and Sushi multiple domains 3)基因是二十一世纪新发现的抑癌基因,位于人类基因组第8号染色体上。目前证实CSMD3在神经系统、肺、肝、脾等多种器官有表达。同时,越来越多的研究发现CSMD3的表达异常与多种疾病,尤其是癌症的发生发展密切相关。例如CSMD3基因常在颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)、乳腺癌发生基因缺失,而且该缺失与NSCLC的发展与预后相关。低表达的CSMD3蛋白与肿瘤分化、淋巴结转移和肿瘤大小密切相关。这一研究结论与本研究在20例肺腺癌配对样本中的结果不谋而合。以往对于CSMD3在肺癌中的研究多集中在相关性研究层面,对于CSMD3是如何影响肺癌发生发展尚属未知,本研究将CSMD3作为切入点,从组织水平和细胞水平对CSMD3在肺癌组织与正常组织中表达差异、TCGA数据库中CSMD3与肺癌患者生存期等方面进行相关性研究,同时对于CSMD3通过何种途径影响肺腺癌的发生和发展进行深入研究,相信本研究将为肺腺癌的早期诊断与预后、新型靶向治疗方法的开发提供基础数据与理论支持。第一部分CSMD3与肺腺癌发生发展的机制研究研究目的:研究CSMD3在肺腺癌组织样本与A549细胞系的表达变化;了解CSMD3对肺腺癌细胞系A549增殖、迁移、侵袭能力的影响;研究当CSMD3表达量下调时对下游基因表达量的影响。研究方法:本研究首先利用Real-time PCR和Western Blot技术对收集的20例肺腺癌患者的癌-癌旁组织样本中CSMD3的表达量分别在转录水平和翻译水平进行研究,利用TCGA数据库研究CSMD3表达量与肺腺癌患者生存期的相关性。接着,构建CSMD3的敲减慢病毒载体并转染A549细胞系,利用细胞划痕实验对A549细胞系的迁移能力进行研究,探讨CSMD3对A549细胞系迁移能力的影响,利用CCK-8技术对CSMD3敲减的A549细胞系细胞活性进行研究,探究CSMD3对A549细胞系增殖能力的影响,利用transwell小室实验对CSMD3敲减条件下A549细胞系侵袭能力进行研究。最后,利用人基因表达谱芯片,对CSMD3敲减后发生差异表达的基因进行研究,并利用Real-time PCR技术对差异基因进行验证。研究结果:1.在对20例肺腺癌癌-癌旁组织样本的检测中发现,CSMD3基因不论在转录水平还是在蛋白水平,在癌组织中的表达量均低于癌旁组织。2.在对TCGA数据库中肺腺癌数据进行分析发现,CSMD3基因表达量与肺腺癌患者生存期未发现具有显著的相关性(P<0.05)。3.人工敲减CSMD3的A549肺腺癌细胞系,其增殖能力、迁移能力和侵袭能力显著提高(P<0.05)。4.在人表达谱芯片检测中发现,人工敲减CSMD3的A549肺腺癌细胞系与对照组相比,共有887个基因表达量发生改变,其中包括653个上调基因。根据聚类分析结果,差异基因功能主要涉及多个癌症相关功能。研究结论:虽然CSMD3与肺腺癌患者生存期没有显著相关性,但本研究数据显示,CSMD3在癌-癌旁组织中表达量具有差异显著,并且与A549细胞系的增殖、迁移、侵袭能力密切相关,提示CSMD3可能间接参与了肺腺癌的发生与发展。与此同时本研究发现CSMD3的人工敲减,导致了TCTP和PLOD2两个与癌症相关基因表达量的上调,接下来我们将对于CSMD3是如何通过上述两个基因影响肺腺癌发生发展进行深入的研究。第二部分CSMD3通过TCTP影响肺腺癌A549细胞系上皮间质转化功能研究目的:在上一部分的研究中,我们发现CSMD3的下调能够促进肺腺癌A549细胞系的增殖、迁移与侵袭能力,同时发现CSMD3能够导致TCTP基因表达量显著上调。本部分我们进一步研究CSMD3如何通过TCTP影响A549细胞系迁移与转移能力,探讨TCTP在表达量上调或下调时A549细胞功能的影响。研究方法:首先利用本研究收集的20例肺腺癌患者组织样本,对TCTP基因在癌-癌旁组织中的表达情况、与肿瘤分级分期、肿瘤尺寸的相关性进行研究,同时利用TCGA数据库对TCTP表达量与患者生存期相关性进行探讨。接下来,本研究构建TCTP基因敲减与过表达慢病毒载体并转染A549细胞系,对TCTP敲减和过表达效率进行验证后,分别利用细胞划痕实验、细胞侵袭实验研究TCTP分别在敲减和过表达情况下,对A549细胞迁移与转移能力的影响。与此同时,分别在TCTP敲减和过表达情况下,利用Western Blot技术和免疫荧光染色技术对肺腺癌A549细胞系上皮间质转化标志蛋白:α-SMA、ZEB1、E-cadherin、P53的表达情况进行研究,探讨TCTP在A549细胞系上皮间质转化过程的作用。此外,我们还利用Real-time PCR在TCTP基因敲减(过表达)A549细胞系中研究了miR-200家族的表达情况,以探讨TCTP表达量变化是如何影响肺腺癌A549细胞系上皮间质转化的。研究结果:1.在对20例肺腺癌癌-癌旁组织样本的检测中发现,TCTP基因不论在转录水平还是在蛋白水平,在癌组织中的表达量均高于癌旁组织(P<0.05)。2.在对TCGA数据库中肺腺癌数据进行分析发现,TCTP的表达量与肺腺癌患者生存期显著相关(P<0.01),其中低表达组中位生存期为78.5个月,高表达组中位生存期仅为61.2个月,即TCTP表达量高与肺癌患者生存期短具有显著相关性。3.人工敲减TCTP的A549肺腺癌细胞,在划痕实验中与对照组相比,TCTP敲减会导致迁移效率显著降低(P<0.05),在transwell实验中,与对照组相比,TCTP敲减能显著减少透过transwell小室的细胞数量(P<0.05)。4.人工敲减TCTP的A549细胞系上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达量相比对照组提高,而间质细胞标志蛋白α-SMA表达量显著降低,P53表达量显著提高,提示TCTP的敲减可能抑制A549细胞系上皮间质转化过程。5.TCTP过表达的A549细胞系,在划痕实验中会导致迁移效率的显著提高(P<0.05),同时在transwell实验中,与对照组相比,TCTP过表达能显著增加透过transwell小室的细胞数量(P<0.05)。6.过表达TCTP的A549细胞系,上皮间质细胞标志蛋白E-cadherin表达量相比对照组降低,而间质细胞标志蛋白α-SMA和ZEB1表达量显著提高,P53表达量显著降低,提示TCTP的过表达可能促进A549细胞系上皮间质转化过程。7.miR-200家族在TCTP过表达A549细胞系中表达量发生下调,而在TCTP敲减的A549细胞系中表达量上调。研究结论:在过表达TCTP基因的A549细胞系中发现,其迁移能力和侵袭能力均发生显著提高,此外上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达量下调,而间质细胞标志蛋白α-SMA和ZEB1表达量上调,同时miR-200家族的表达量也发生下调,此外,通过TCTP敲减的A549细胞从反面进一步确认了上述结果。提示CSMD3表达量下调能够导致TCTP表达量的提高,进而可能通过抑制miR-200家族表达量的途径促进了肺癌细胞A549上皮间质转化的功能,并进一步促进了肿瘤的迁移与侵袭能力。第三部分CSMD3通过PLOD2影响肺腺癌A549细胞系侵袭与转移能力研究目的:在第一部分的研究中我们发现CSMD3的敲减能够在促进肺腺癌细胞系A549的增殖、迁移与侵袭能力的同时,导致了PLOD2基因的表达量上调。本部分我们进一步研究了CSMD3是如何通过PLOD2影响A549细胞功能,同时探讨了PLOD2对于肺腺癌增殖、迁移与侵袭能力的影响。研究方法:本研究首先利用收集的20例肺腺癌患者组织样本,对PLOD2基因在癌-癌旁组织中的表达情况进行研究,并利用TCGA数据库对PLOD2表达量与肺腺癌患者生存期进行相关性分析。接着我们构建了PLOD2敲减的慢病毒表达载体并转染肺腺癌A549细胞系,并研究了PLOD2敲减对肺腺癌A549细胞系增殖、迁移和侵袭能力的影响。研究结果:1.在对20例肺腺癌癌-癌旁组织样本基因表达量检测中发现,PLOD2基因在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织(P<0.05)。2.在对TCGA数据库中肺腺癌数据进行分析发现,PLOD2的表达量与肺腺癌患者生存期显著相关(P<0.01),其中低表达组中位生存期为84.1个月,高表达组中位生存期仅为52个月,即PLOD2高表达与肺癌患者预后差密切相关。3.在划痕实验中,人工敲减PLOD2的A549肺腺癌细胞与对照组相比,迁移效率显著增高(P<0.05),同时在transwell实验中与对照组相比,PLOD2敲减能显著减少透过transwell小室的细胞数量(P<0.05)。研究结论:经过研究发现,PLOD2在肺腺癌癌组织中相比癌旁组织表达量提高,同时发现PLOD2的高表达与肺腺癌患者预后差密切相关。第一部分的研究发现CSMD3的敲减能够导致PLOD2的表达量提高,然而PLOD2的敲减对肺腺癌A549细胞系的影响较为复杂,表现在PLOD2敲减能够抑制肺腺癌A549细胞系的增殖与侵袭能力,但是迁移能力却得到了提高。