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【目的】无机砷是人类确认致癌物,但由于砷与机体作用十分复杂,加之无机砷化合物至今尚未成功复制出致癌动物模型,其确切的致癌机制仍未明确。目前砷致氧化应激机制与砷致表观遗传改变是砷致癌机制的两大热点假说。Keap1-Nrf2/ARE是机体最重要的抗氧化信号通路,其能够有效地保护机体免受各类氧化损伤。然而,近年来研究发现该信号通路持续活化则与肿瘤的发生、发展及耐药性密切相关。但该信号通路在肿瘤发生过程中的不同阶段是如何变化及其变化机制目前尚不清楚。本课题以低剂量亚砷酸钠(Na As O2)长期染毒人皮肤角质形成细胞(Human keratinocyte cell,Ha Ca T)诱发恶性转化为载体,研究ROS及Keap-Nrf2/ARE信号通路相关蛋白在恶性转化过程中不同阶段的动态变化,进而更深一步探讨导致该信号通路表达变化可能的分子机制,为砷致癌机制研究提供新思路,同时为为癌症的预防和治疗过程中合理有效地利用和控制该通路提供新策略。【方法】1.建立低水平Na As O2长期暴露诱发Ha Ca T细胞发生恶性转化模型:常规培养Ha Ca T细胞至贴壁并恢复形态后,换用含0.0和1.0μM Na As O2的DMEM完全培养基连续培养至35代(约18周)。在该过程中不同阶段(21代、28代、35代)进行细胞生长动力学及MMP-9分泌活性检测,软琼脂克隆实验检测其克隆形成能力。2.低水平Na As O2致Ha Ca T细胞恶性转化不同阶段(0、1、7、14、21、28、35代)Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关指标检测:采用流式细胞仪检测ROS水平变化;生化法检测MDA含量及SOD酶活力变化;采用Western-Blot方法检测细胞总蛋白及核浆蛋白中Nrf2、HO-1、Keap1及Bach1蛋白表达水平。3.低水平Na As O2致Ha Ca T细胞恶性转化中后期(14、28、35代)Keap1基因启动子区DNA甲基化检测:提取相关代数Ha Ca T细胞基因组DNA,采用亚硫酸氢盐修饰后测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)检测Keap1基因启动子区DNA甲基化情况。4.5-Aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-d C)处理后各指标检测:将正常Ha Ca T细胞及1.0μM Na As O2诱导的恶性转化的Ha Ca T细胞(T-Ha Ca T)分别培养于含有0或10μM5-Aza-d C的DMEM培养基中5天后,采用BSP法进行Keap1基因启动子区DNA甲基化检测,采用Western-Blot法检测Keap1-Nrf2/ARE信号通路各蛋白在总蛋白与核浆蛋白中的表达变化,软琼脂克隆法检测细胞克隆形成能力。【结果】1.用1.0μM Na As O2对Ha Ca T细胞进行连续染毒后发现:随着染毒代数的增加,Ha Ca T细胞生长速率逐渐加快,其倍增时间在35代时明显少于传代对照组细胞,MMP-9分泌水平在35代也明显升高,染毒35代细胞能够在软琼脂中形成明显的克隆集落,而正常Ha Ca T细胞在软琼脂中几乎不能生长(p均<0.05)。2.对低水平Na As O2致Ha Ca T细胞恶性转化不同阶段ROS及Keap1-Nrf2/ARE信号通路各相关指标进行检测发现:在染毒初期(1代)Ha Ca T细胞内ROS水平明显升高,随后到染毒14代其表达呈轻微下降后上升趋势,而在14代以后随代数增加即恶性程度增加其ROS水平逐渐降低,在35代时其活力明显低于初代(0代)Ha Ca T细胞(p<0.05)。MDA含量在染毒1代时达到峰值,随后呈缓慢下降趋势,但与同代数传代对照组细胞相比均无统计学差异。在染毒初期(1代)细胞内的Nrf2及HO-1表达水平和SOD酶活力水平均有所上升。随后至暴露14代呈现先上升后下降趋势,在砷暴露后期(21代以后)Nrf2在细胞核中持续累积,且HO-1表达水平及SOD酶活力也呈持续升高趋势。相反的,Keap1蛋白表达水平在暴露14代以后则呈持续下降趋势。Bach1在胞浆中的表达水平随着染毒代数的增加逐渐升高,而总蛋白中Bach1表达水平与传代对照组相比则无明显变化。3.对低水平Na As O2致Ha Ca T细胞恶性转化中后期Keap1基因启动子区甲基化水平检测发现:在0.0μM Na As O2组14、28及35代细胞中,Keap1基因启动子区(TSS之前,-433bp~-1bp)存在较少的甲基化Cp G位点,其甲基化率分别为6.0±3.1%、7.1±2.8%和6.3±3.8%,相互之间均无统计学差异。而在1.0μM Na As O2组14、28及35代细胞中,Keap1基因启动子区(TSS之前,-433bp~-1bp)则呈现明显甲基化状态,且随着染毒代数的增加,其甲基化程度逐渐增加,其甲基化率分别为51.1±6.5%、77.1±6.5%和90.6±4.3%,与同代数0.0μM Na As O2组细胞相比均有明显统计学差异(p<0.05),且三组之间比较也均有统计学差异(p<0.05)。而在TSS之后的第一启动子区内(+1bp~+159bp)的16个Cp G位点无论在0.0μM Na As O2组还是在1.0μM Na As O2组均无甲基化发生。4.对亚砷酸钠所致的恶性转化的Ha Ca T细胞(T-Ha Ca T)进行5-Aza-d C处理后发现:经5-Aza-d C处理后T-Ha Ca T细胞中Keap1启动子区(TSS之前,-433bp~-1bp)甲基化位点明显减少,甲基化率下降至9.7±2.4%,较T-Ha Ca T细胞(93.1±2.4%)相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。5-Aza-d C能够明显恢复T-Ha Ca T细胞中Keap1在总蛋白和核、浆蛋白中的表达水平,降低T-Ha Ca T细胞Nrf2的核累积水平和HO-1的表达水平。此外,经5-Aza-d C处理后的T-Ha Ca T细胞软琼脂克隆形成能力也较未处理的T-Ha Ca T细胞明显降低(p<0.05)。【结论】1.低水平亚砷酸钠长期染毒Ha Ca T细胞能够诱导其发生恶性转化。2.低水平亚砷酸钠长期暴露致Ha Ca T细胞恶性转化过程中伴随氧化-抗氧化系统的逐渐失衡,恶性转化中后期ROS水平逐渐降低,而Nrf2介导的抗氧化水平则持续升高。3.Keap1基因启动子区甲基化水平在恶性转化中后期逐渐升高导致Keap1蛋白表达降低是Nrf2介导的抗氧化水平持续升高的诱因。4.降低Keap1基因启动子区甲基化水平能够恢复Keap1蛋白表达水平,进而降低恶性转化细胞内Nrf2介导的抗氧化水平,最终减轻其恶性程度。5.砷致氧化应激机制与砷致表观遗传改变两大热点假说之间可能相互影响,共同参与到砷致肿瘤发生和发展过程中。