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研究背景与目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最严重的微血管并发症之一,该病是导致终末期肾病的重要原因之一。足细胞是形成肾小球滤过屏障的重要组成部分,大量研究表明足细胞损伤在糖尿病肾病蛋白尿产生及发展过程中起关键性作用。足细胞损伤被认为是影响糖尿病肾病预后的重要因素之一,因此探究足细胞损伤的分子机制及具有足细胞保护作用的靶点,对于延缓糖尿病肾病的发生及进展具有重要作用。近年来多种研究表明线粒体在足细胞损伤及糖尿病肾病的进展过程中起重要作用,而高糖环境下参与足细胞线粒体损伤的分子机制及信号通路仍有待进一步研究。Sirtuins（silent information regulator 2 proteins）是进化上保守的腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD+）依赖的组蛋白去乙酰化酶,其家族包括SIRT 1-7,发挥多种不同的生物学作用。Sirtuins 6（SIRT6）是Sirtuins家族的重要成员,定位于细胞核,对组蛋白H3K9和H3K56发挥去乙酰化作用,此外还有单-ADP-核糖基转移酶活性及长链酰基化作用。有研究表明SIRT6可通过多重作用改善高糖诱导的足细胞损伤,包括抑制高糖刺激足细胞引起的炎性因子分泌及足细胞凋亡,改善细胞骨架重排及增强足细胞自噬。目前有研究提示SIRT6可参与保护心肌、骨骼肌细胞线粒体功能,而SIRT6是否参与调控高糖诱导的足细胞线粒体损伤目前尚不明确。本研究通过构建糖尿病肾病小鼠模型及高糖环境下体外培养人足细胞,观察足细胞线粒体形态、功能改变,同时收集糖尿病肾病患者肾穿刺标本,评估SIRT6在患者足细胞、糖尿病肾病小鼠足细胞及体外培养人足细胞中的表达改变;通过转染SIRT6质粒及SIRT6小干扰RNA观察SIRT6表达改变对高糖诱导的人足细胞线粒体形态及功能的影响;通过转染SIRT6全长质粒、SIRT6去乙酰化酶活性位点缺失质粒及下调AMPK表达,探讨SIRT6介导高糖诱导足细胞线粒体损伤的机制。方法:第一部分:12只雄性C57BL/6小鼠随机分为糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）组和正常对照组,DN组小鼠首次尾静脉注射链脲佐菌素（streptozocin,STZ）缓冲液（75mg/kg/10ml）,五日后追加注射STZ缓冲液（150 mg/kg/10ml）,正常对照组小鼠予以等量的生理盐水替代STZ。每周末监测小鼠体重、24h尿量、血糖、尿微量白蛋白/尿肌酐（ACR）变化。造模12周后处死小鼠,称量小鼠肾重、留取血标本、24h尿标本及肾组织标本,用于分子生化、病理及免疫染色等后续检测。以正常糖浓度（5.0 mmol/L）体外培养分化后的人足细胞24h作为正常对照组（normal group,NG）,以糖浓度（30 mmol/L）体外培养分化后的人足细胞24h作为高糖组（high glucose,HG）。收集临床肾穿刺活检确诊为DN患者的肾组织标本,肾脏肿瘤切除术后肿瘤周边正常肾组织为正常对照。HE和PAS染色观察小鼠肾脏病理改变,透射电镜观察小鼠肾小球足细胞及体外培养人足细胞细胞超微结构改变,Mito Tracker Green染色观察体外培养人足细胞细线粒体数量改变,Mito SOX Red染色观察各组人足细胞线粒体内ROS含量改变,JC-1染色检测各组足细胞线粒体膜电位的变化,流式细胞技术评价各组足细胞凋亡水平变化。免疫荧光检测SIRT6在DN患者肾小球足细胞、小鼠肾小球足细胞及体外培养人足细胞的表达水平,免疫印迹评价SIRT6在小鼠肾小球及体外培养的人足细胞中的表达水平。第二部分:体外培养人足细胞,以SIRT6全长质粒或SIRT6 si RNA转染至人足细胞,质粒转染24h或si RNA转染48h后予以高糖刺激24h,分为正常对照组、高糖组、高糖+全长质粒转染组、高糖+空载质粒转染组、正常对照+SIRT6 si RNA转染组和正常对照+对照si RNA转染组。透射电镜观察小鼠肾小球足细胞及体外培养人足细胞细胞超微结构改变,Mito SOX Red染色观察各组人足细胞线粒体内ROS含量改变,JC-1染色检测各组足细胞线粒体膜电位的变化,流式细胞技术评价各组足细胞凋亡水平变化。第三部分:免疫印迹评价p-AMPK及AMPK在DN小鼠肾小球及高糖刺激的人足细胞中的表达水平。体外培养人足细胞,以SIRT6全长质粒或去乙酰化酶活性位点（H133Y）缺失SIRT6质粒转染人足细胞,并予以AMPK抑制剂Compound C预处理已转染SIRT6全长质粒的足细胞,以上预处理完毕后加入高糖刺激24h,分为正常对照组、高糖组、高糖+全长质粒转染组、高糖+空载质粒转染组、高糖+活性位点缺失质粒转染组、高糖+全长质粒转染+Compound C组。透射电镜观察各组体外培养的人足细胞细胞超微结构改变,Mito SOX Red染色观察各组人足细胞线粒体内ROS含量改变,JC-1染色检测各组足细胞线粒体膜电位的变化,流式细胞技术评价各组足细胞凋亡水平变化。免疫印迹检测各组人足细胞SIRT6、p-AMPK、AMPK、H3K9AC和H3K56AC的表达水平。结果第一部分:（1）DN小鼠出现明显系膜细胞增生、基底膜增厚及肾小球足突广泛融合,与正常对照组相比,DN小鼠体重显著减轻（P<0.05）、血糖升高（P<0.05）,肾重/体重比升高（P<0.05）、ACR显著升高（P<0.05）;（2）高糖刺激诱导DN小鼠肾小球足细胞和体外培养人足细胞线粒体形态异常,线粒体出现不同程度肿胀、空泡样变、线粒体嵴断裂及消失;（3）高糖刺激可诱导体外培养人足细胞线粒体数目减少（P<0.05）、线粒体内ROS水平显著升高（P<0.05）、线粒体膜电位下降（P<0.05）,足细胞凋亡增加（P<0.05）;（4）SIRT6可广泛分布于人体肾小球多种细胞中,DN患者肾小球足细胞SIRT6表达明显减少（P<0.05）。DN小鼠肾小球足细胞及体外高糖刺激的人足细胞SIRT6表达减少（P<0.05）。第二部分:（1）SIRT6质粒转染可改善高糖诱导的人足细胞线粒体形态紊乱,足细胞线粒体肿胀及空泡样变有所缓解;（2）转染SIRT6质粒细胞与高糖组相比线粒体内ROS水平显著降低（P<0.05）、线粒体膜电位显著上升（P<0.05）,足细胞凋亡下降（P<0.05）;（3）转染SIRT6 si RNA细胞与正常对照组相比,线粒体肿胀、线粒体嵴排列紊乱及脊断裂程度加重;（4）转染SIRT6 si RNA细胞与正常对照组相比线粒体内ROS含量升高（P<0.05）、线粒体膜电位下降（P<0.05）,足细胞凋亡增加（P<0.05）。第三部分:（1）DN小鼠肾小球及体外高糖诱导的人足细胞AMPK去磷酸化水平增加（P<0.05）;（2）以SIRT6全长质粒或去乙酰化酶活性位点（H133Y）缺失SIRT6质粒转染人足细胞,均可缓解高糖诱导的人足细胞线粒体损伤及足细胞凋亡,同时上调AMPK磷酸化水平;（3）抑制AMPK对SIRT6表达无影响,可减弱高糖环境下转染SIRT6全长质粒介导的足细胞线粒体保护作用;（4）SIRT6全长质粒转染可抑制高糖诱导的人足细胞H3K9及H3K56位点乙酰化水平上升,去乙酰化酶活性位点（H133Y）缺失SIRT6质粒转染对H3K9及H3K56位点乙酰化水平无影响。结论:AMPK是SIRT6的下游信号分子,SIRT6通过调控AMPK信号通路介导高糖诱导的足细胞线粒体损伤,该作用不依赖于SIRT6对H3K9及H3K56位点的去乙酰化作用。