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B-Myb是高度保守的转录因子Myb家族的成员之一,在有增殖能力的细胞中普遍表达,并在细胞周期进程中起到重要作用。有研究发现,B-Myb在很多癌症细胞中高表达,如乳腺癌、肝细胞癌、神经母细胞瘤等。这提示我们,B-Myb在癌症的发生发展过程中可能发挥重要作用。迄今为止,B-Myb在肺癌中的表达及其作用机制尚不明确,故本论文主要研究B-Myb在肺癌组织样本中的表达水平及其对肺癌细胞增殖、迁移侵袭、肿瘤形成的影响,并探究其分子机制。第一部分B-Myb过表达对肺癌细胞增殖、迁移侵袭及肿瘤形成的影响及机制研究目的:1.研究B-Myb在肺癌组织中表达与肿瘤的临床病理特征之间的关系。2.检测B-Myb过表达对肺癌细胞增殖、细胞周期、迁移侵袭、肿瘤形成的影响。3.初步阐明B-Myb过表达促进肺癌细胞增殖、迁移侵袭及肿瘤形成的分子机制。方法:1.采用q RT-PCR、western blot及IHC检测肺癌组织和正常肺组织中B-Myb的表达水平,统计分析B-Myb在肺癌组织中表达与肿瘤的临床病理特征之间的关系。2.采用慢病毒感染的方法将目的基因B-Myb转染到肺癌细胞中,建立B-Myb过表达的细胞模型;q RT-PCR和western blot检测B-Myb及靶基因的m RNA和蛋白的表达;CCK-8检测细胞增殖;FCM检测细胞周期;划痕实验和Transwell检测细胞迁移侵袭;裸鼠成瘤实验检测肺癌细胞体内成瘤能力。3.RNA-seq检测肺癌细胞系H1299的B-Myb过表达组样本与对照组样本,GO富集分析和pathway富集分析筛选差异表达的基因及相关的信号通路。结果:1.检测40例肺癌患者和7例对照正常肺组织c DNA芯片中B-Myb的m RNA表达水平,并通过IHC检测69例肺癌患者及3例正常肺组织芯片中B-Myb的蛋白表达水平。统计分析显示,肺癌组织中B-Myb的m RNA和蛋白表达水平均显著高于正常肺组织,B-Myb的蛋白表达主要定位在细胞质内,且B-Myb的表达量与肿瘤的大小、淋巴结转移以及转移癌等密切相关。进一步检测肺癌6个细胞系H1299、A549、H157、H446、H524和H460中B-Myb的m RNA表达水平,结果发现在肺癌细胞H1299和A549中B-Myb的m RNA表达相对较低。2.肺癌细胞系H1299和A549的B-Myb过表达细胞模型成功建立,且过表达组较对照组的目的基因B-Myb表达量至少高出4倍;CCK-8结果显示,B-Myb过表达促进肺癌细胞的增殖;FCM检测结果显示,B-Myb过表达组较对照组S期细胞数量显著增加,且G1期细胞数量显著减少;划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,B-Myb过表达促进肺癌细胞迁移;Transwell侵袭结果显示,B-Myb过表达促进肺癌细胞侵袭;体内实验结果显示,B-Myb过表达促进肺癌细胞的肿瘤形成。3.RNA-seq的检测和分析结果显示,B-Myb过表达诱导390个基因的差异表达,其中表达上调的有300个基因,表达下调的有90个基因。GO富集分析结果显示差异表达的基因功能主要与细胞外基质、生长因子、细胞发育进程有关。pathway富集分析结果显示主要的信号通路包括细胞粘附因子通路、PI3K-Akt信号通路、癌症通路及Ras信号通路。我们对部分差异表达的基因CCNA1、COL11A1、COL6A1、FN1、MMP2、NID1、FLT4、SPARC、INSR、IDH2、PDK3和IGFBP3进行q RT-PCR检测,差异表达的趋势与RNA-seq数据分析结果一致。进一步western blot分析显示,B-Myb过表达显著提高ERK和Akt磷酸化水平,能够激活ERK和Akt信号通路。结论:1.肺癌组织中B-Myb的m RNA水平和蛋白水平显著高于正常肺组织,B-Myb的蛋白表达主要定位在细胞质内,且B-Myb的表达量与肿瘤的大小、淋巴结转移以及转移癌等密切相关。2.体外实验显示,B-Myb过表达能够促进细胞的增殖、细胞周期进程和迁移侵袭;体内实验显示,B-Myb过表达能够提高肺癌细胞的肿瘤形成能力。3.RNA-seq检测分析结果显示,差异表达的基因功能主要与细胞外基质、生长因子、细胞发育进程有关,对部分差异表达的基因进行q RT-PCR检测,差异表达的趋势与RNA-seq数据分析结果一致,pathway富集分析结果显示主要的信号通路包括细胞粘附因子通路、PI3K-Akt信号通路、癌症通路及Ras信号通路。Western blot分析显示,B-Myb过表达显著提高ERK和Akt磷酸化水平,能够激活ERK和Akt信号通路,B-Myb能够促进肺癌的发生发展,或许部分是通过对ERK和Akt信号通路进行调节。第二部分B-Myb干扰对肺癌细胞增殖、迁移侵袭及肿瘤形成的影响及机制研究目的:1.检测B-Myb干扰对肺癌细胞增殖、周期、迁移侵袭、肿瘤形成等功能的影响。2.初步阐明B-Myb干扰抑制肺癌细胞增殖、迁移侵袭及肿瘤形成的分子机制。方法:1.采用慢病毒感染和瞬时转染的方法将目的基因B-Myb的干扰序列转染到肺癌细胞中,建立B-Myb干扰的细胞模型;q RT-PCR和western blot检测B-Myb及靶基因的m RNA和蛋白的表达;CCK-8检测细胞增殖;FCM检测细胞周期;划痕和Transwell检测细胞迁移侵袭;裸鼠成瘤检测体内成瘤能力。2.RNA-seq检测H1299的B-Myb干扰组与对照组样本,GO富集分析和pathway富集分析筛选出差异表达的基因及相关的信号通路。结果:1.肺癌细胞H1299和A549的B-Myb干扰模型成功建立,且B-Myb干扰效率大于60%;CCK-8结果显示,B-Myb干扰抑制肺癌细胞的增殖;FCM检测结果显示,肺癌细胞B-Myb干扰后S期细胞数量减少,且G1期细胞数量显著增加;划痕和Transwell迁移结果显示,B-Myb干扰抑制肺癌细胞迁移;Transwell侵袭结果显示,B-Myb干扰抑制肺癌细胞侵袭;体内实验结果显示,B-Myb干扰抑制肺癌细胞的肿瘤形成。2.RNA-seq的检测和分析结果显示,B-Myb干扰诱导13362个基因差异表达,其中包括6343个基因表达上调,7019个基因表达下调。GO富集分析显示差异表达的基因主要参与调控细胞信号转导、细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡及迁移侵袭等功能,Pathway富集分析的主要是MAPK信号通路、凋亡和细胞周期相关信号通路。我们对部分差异表达的基因COL11A1、FLT4、SPARC、IDH2、PDK3和IGFBP3进行q RT-PCR检测,差异表达的趋势与RNA-seq数据分析结果一致。结论:1.体外实验显示,B-Myb干扰能够抑制肺癌细胞的增殖、迁移侵袭、且S期细胞减少;体内实验显示,B-Myb干扰能够降低肺癌细胞的肿瘤形成能力。2.RNA-seq检测并分析显示,细胞外基质、生长因子、细胞发育进程都存在基因表达的不同程度的下调。对部分差异表达的基因进行q RT-PCR检测,差异表达的趋势与RNA-seq数据分析结果一致,pathway富集分析结果显示,主要的信号通路包括MAPK信号通路、凋亡和细胞周期相关信号通路。