研究背景肝脏疾患是影响人类生活质量和生命健康的重要疾病之一,这些疾病都将逐渐发展,演变为肝纤维化或肝硬化,最终出现肝脏功能衰竭。对于各种类型的终末期肝病,肝移植在理论上应该为最理想的治疗选择。但由于供体缺乏及保存供体的时间限制的原因,很多病人在等待肝移植的过程中即死亡。生物人工肝系统能使终末期肝病病人桥接肝移植。肝细胞具有强大的再生能力,临时应用生物人工肝系统也可以解决急性肝功能的失代偿,促进肝细胞再生,肝功能可以暂时恢复,争取到等待肝移植的时间。经过几十年的研究,生物人工肝系统巳从非生物型、生物型人工肝系统发展到混合型人工肝系统,国内外已经有不少种类的人工肝系统应用于临床。但如何获得高质量、来源丰富的生物人工肝用肝细胞是当前面临的最大问题。由于肝脏移植的供体短缺、术后的免疫排斥以及昂贵的治疗费用等问题严重制约了肝脏移植的广泛应用;生物人工肝由于肝细胞来源局限以及生物安全性等因素而受到限制。寻求一种相对简便、安全有效、费用低廉的替代治疗方案成为临床迫切需要解决的问题。目前干细胞移植成为研究的热点,由于终末期肝病患者自身肝细胞已极度破坏,仅存的肝细胞不能维持自身的生理功能从而需要临床治疗。而同种异体和异种肝细胞移植由于受免疫排斥、动物源性传染病、伦理等方面的制约而不能应用于临床。目前干细胞的研究已在医学领域取得令人瞩目的成就,也为广大临床工作者开拓了新的思路,利用细胞移植治疗肝病成为新的热点,但基础研究的报道很多,临床研究仅北京等极少数地区报道有成功病例。干细胞的发现为解决肝细胞源短缺的问题提供了很好的思路。1999年以来国外学者相继提出:骨髓干细胞能够在鼠肝内转化为肝卵圆细胞甚至成熟的肝细胞和胆管细胞。Verfaillie等研究表明从大鼠、小鼠和人的骨髓中分离得到多能成年祖细胞(multi-potent adult progenitor cells,MAPCs),该细胞体外经FGF4和HGF诱导可分化为功能肝细胞,此细胞能合成尿素、白蛋白、糖原,具有细胞色素P450活性,能吸附α低密度脂蛋白。将这一亚群细胞移植至肝脏,用绿色荧光蛋白和白蛋白双标技术可证实其已经分化为功能完备的肝细胞。以色列的科学家发现:当肝脏遇到损害时,它会产生大量的信号分子来诱导骨髓干细胞转移和分化,修复受到损害的肝脏细胞。总结国内外的大量基础研究可以证实:骨髓中存在内分化为肝细胞的干细胞,将骨髓中的干细胞移植到肝脏后在肝脏特定的微环境内可横向分化成有功能的肝细胞。我们的前期研究亦证实:体内、体外骨髓干细胞均可横向分化为有生物学功能的肝细胞,称为可塑性,结合国内外的研究成果我们总结出自体骨髓干细胞在组织再生方面具有特定的优势:①完全是自身的遗传背景,不受细胞来源和移植免疫或排斥的限制;②成人组织干细胞的分化潜能相对比较局限,更容易诱导向特定的组织细胞分化,也可直接用于体内组织的原位修复;③无伦理学方面的困扰,更易于临床应用。目前国内外学者亦开始自体骨髓干细胞移植的研究,其中骨髓干细胞移植治疗心肌梗死及神经系统疾病亦屡见成功报道,肝病治疗方面北京军区总医院报道经肝动脉骨髓干细胞移植治疗肝硬化20例,其中14例有效、6例无效。本研究在课题组前期理论研究及动物体外、体内研究的基础上,严格选择临床适应病例,术后监测生化指标及观察临床症状判断治疗效果,为临床大规模开展自体骨髓干细胞移植奠定基础。第一章人骨髓干细胞的分离目的:建立简便安全的自体骨髓干细胞分离方法,同时检验分离所得细胞的存活率、有无细菌感染等。方法:应用密度梯度离心法分离人骨髓干细胞,台盼兰染色检验细胞的存活率,实验室细菌学检验判断有无细菌感染。结果:密度梯度离心法能分离出纯度较高的HMSCs,台盼兰染色显示细胞存活率在95%以上,细菌学检验无细菌感染。结论:应用密度梯度离心法可得到纯度较高的HMSCs,细胞存活率在95%以上且无细菌感染。第二章自体骨髓干细胞移植治疗肝功能不全的临床研究目的:探索自体骨髓干细胞移植对肝功能不全患者的治疗效果,为干细胞移植的临床大规模开展提供基础。方法:我们选择了6例肝功能不全患者均来源于我所住院患者,年龄在44～69岁;患者在无菌条件下,从骼后上棘抽取骨髓50 ml,分离纯化骨髓干细胞。在局部麻醉下,行肝动脉介入将分离的骨髓干细胞移植于肝脏;患者在移植后不同时间,1周、2周、4周、8周、12周进行肝功能检测;观察在移植后不同时间症状改善情况及术后的不良反应情况。结果:我们发现在移植12周后,我们观察了患者在干细胞移植前后不同时间肝功能的变化,发现患者在移植1周,2周,4周,8周,12周后,谷丙转氨酶(ALT)逐渐降低,由平均98.4 IU/L降至41.5 IU/L;总胆红素(TB IL)由平均136.5mol/L降至78.4 mol/L;肌酐由112.3降至72.1;白蛋白(ALB)逐渐升高,由平均23.3g╱L升至32.6 g/L;凝血酶原时间(PT)下降不明显。我们进一步观察了自体骨髓干细胞移植后患者的生存情况发现,患者在移植12周生存率为100%;1例在7个月后死亡。我们观察了在自体骨髓干细胞移植后患者症状的变化,发现移植后大多数患者有明显的症状改变,移植后12周食欲改善的3例(75%);精神体力好转3例(75%);腹胀减轻2例(50%)。在4例随访患者中未发现严重并发症,术后有轻度恶心1例,发热1例,经对症治疗后好转,未见其他严重不良反应。结论:自体骨髓干细胞移植治疗后,患者肝功能逐步改善,症状好转,表明骨髓干细胞移植对肝衰竭患者的治疗有效且副作用小,安全。