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细胞自噬是一种在真核细胞中高度受调控的、溶酶体依赖性的重要细胞代谢过程,主要参与降解细胞内的蛋白聚集体、衰老损伤的细胞器以及侵入细胞的病原体等。近年来,越来越多的证据表明,在细胞自噬过程中的目标底物识别环节,有一类自噬受体家族蛋白发挥着举足轻重的作用,它的功能异常会引起大量的人类疾病,如癌症、神经退行性疾病以及免疫炎症等。 Optineurin(OPTN)是一个多功能的细胞自噬受体蛋白,在多种选择性的细胞自噬过程中发挥着重要的作用,包括aggrephagy,xenophagy和mitophagy。其突变与多种神经退行性疾病有关联,如,原发性开角型青光眼(POAG)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)等。近年来,越来越多的研究表明,OPTN在选择性细胞自噬中的独特功能能被另一个ALS相关的TBK1激酶所调节。然而,迄今为止,OPTN与TBK1特异性相互作用的分子机制,以及相关的疾病突变位点的致病机理仍不清楚。在本文的研究中,我们首先通过一系列的生化和结构生物学分析,证实了OPTN与TBK1之间的直接相互作用,并且揭示了其形成复合物所需要的最小相互作用区间。然后运用X射线晶体衍射方法成功地解析了OPTN/TBK1的复合物晶体结构,经过详细的结构分析,揭示了OPTN与TBK1相互作用的分子机制。最后,结合解析的OPTN E50K/TBK1突变体复合物晶体结构和相关的生化分析,我们从结构生物学的角度详细地解释了已知的OPTN和TBK1相关的疾病突变位点的致病分子机制。此外,为了揭示TBK1结合不同的接头蛋白是否采用相同的结构模式,我们解析了NAP1/TBK1的复合物晶体结构,通过与OPTN/TBK1的结构比较结合详细的序列比对分析发现,不同的接头蛋白采用类似的结构模式竞争性地结合TBK1。综上所述,我们所有的实验结果不仅为TBK1如何结合和调控OPTN在选择性细胞自噬中的功能提供了一个新的分子机制,而且拓展了我们对于由OPTN和TBK1缺陷所引发的神经退行性疾病的致病机理的理解。 作为典型的可以结合泛素的细胞自噬受体蛋白,OPTN和CALCOCO2/NDP52分别通过其UBAN结构域和UBZ结构域识别不同连接方式的多聚泛素链,从而介导选择性的细胞自噬。但是目前,关于OPTN和CALCOCO2识别多聚泛素链的UBAN和UBZ的结构,以及选择性地结合不同类型的泛素链的分子机制还不清楚。在本文中,通过系统性的生物化学和结构生物学的分析,我们发现:对于OPTN,其UBAN结构域能够特异性地结合M1和K63连接的泛素二聚体(DiUb),并且对M1-DiUb表现出更高的亲和力。此外,我们解析的OPTN_UBAN和M1-DiUb的复合物的晶体结构不仅揭示了一个新颖的UBAN结合M1连接的多聚泛素链的结构模型,而且为解释已知的处于UBAN区间的相关疾病突变位点的致病机制提供了结构基础。关于CALCOCO2,其C末端结合底物的区域包括一个非常动态的锌指结构(ZF1)和一个典型的C2H2型的锌指结构(ZF2),并且仅仅依赖于典型的C2H2型锌指来识别单个泛素和多聚泛素链。我们解析的CALCOCO2_ZF2/mono-Ub的复合物晶体结构不仅解释了CALCOCO2特异性识别泛素的分子机制,而且揭示了一种新的锌指结构结合泛素的作用模式。综合以上数据,我们的实验结果为细胞自噬受体蛋白OPTN和CALCOCO2如何介导被多聚泛素包裹的底物进行自噬降解提供了新的分子机制。