研究背景系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种多发于孕龄期妇女的自身免疫性疾病,常累及机体多个组织器官,发病原因至今不明。SLE的病理特点是多种自身抗体的过量表达和大量免疫复合物的沉积。由于SLE累及多个系统和器官,因此患者的生活质量受到很大影响。在SLE患者机体中,促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子的分泌过量调控紊乱,最终导致了机体组织和器官的炎症反应及损伤。颗粒蛋白前体(Progranulin, PGRN)也称之为颗粒蛋白-上皮素前体(granulin-epithelin precursor, GEP),前列腺癌细胞衍生生长因子(prostatic cancer-cell derived growth factor, PCDGF),上皮素前体(proepithelin)等,由颗粒体蛋白(granulin, GRN)基因编码,是一种具有多种生物学功能的自分泌因子。PGRN大量表达于淋巴细胞,神经元,免疫细胞,增殖活跃的上皮细胞和软骨细胞中。诸多研究发现,PGRN在多种生理性和病理性过程中发挥着关键性的作用。例如胚胎的早期发育,创伤愈合和组织重构,炎症反应,免疫反应等。PGRN也是一个重要的神经营养因子,有研究发现GRN基因变异引起的PGRN蛋白的部分丢失可导致额颞叶痴呆。此外PGRN也是一个参与了软骨发育和降解的重要调节因子。Tang W等报道发现PGRN与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)受体结合,阻断TNF-a的信号转导,从而明显拮抗胶原诱导关节炎小鼠模型的关节炎症反应。因此,PGRN可能是未来治疗自身免疫性疾病的新靶点。然而,PGRN在SLE患者中的表达至今未有报道。糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)是治疗SLE的常用药物,通过基因组途径和非基因组途径抑制许多因子的表达和功能。但是糖皮质激素是否对PGRN的表达有影响尚未明确。基于上述观点,我们在此项研究中检测了SLE患者及健康对照人群外周血中PGRN,IL-6,蛋白酶3(proteinase3,PR3),TNFR, TNF-α的表达浓度及mRNA的表达水平,及抗dsDNA抗体的血清浓度,以探讨PGRN在SLE患者中的作用及其与疾病活动性的关系。此外,还观察了糖皮质激素对PGRN表达水平的影响。研究方法：1.研究对象筛选30例新诊断的SLE患者进入实验组,他们全部符合1997年美国风湿病学院修订的SLE的分类标准。所有实验组患者的SLEDAI (systemic lupus erythematosus disease activity index)评分≥10,入组前都未接受糖皮质激素及其它免疫抑制剂的治疗,并在用药前采集第一次外周血样。入组后所有患者均接受了糖皮质激素治疗,即泼尼松1mg/kg/day。连续给予泼尼松3周后再次采集外周血样。选取30例性别年龄匹配的来我院查体的健康人进入对照组。所有研究对象均签署了山东大学齐鲁医院临床伦理委员会的知情同意书。2.实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)分析各细胞因子mRNA的表达在实验组SLE患者接受泼尼松治疗的前后分别收集5ml外周抗凝血,用红细胞裂解液提取外周血中的单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PMBC),根据说明书用Trizol法提取PMBCs的总RNA。核酸蛋白测定仪初步测定RNA的浓度并标准化至1ug/ml以利于接下来的反转录步骤。用反转录试剂盒获取cDNA后进行实时定量PCR检测PMBCs中PGRN的mRNA的表达水平。3.酶联免疫吸附试验检测外周血清细胞因子的浓度在实验组SLE患者接受泼尼松治疗前后分别收集5ml外周自凝血,凝固后离心分离出血清,储存在-80。C条件下。按照说明书用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测血清中PGRN, IL-6, PR3, TNFR和抗dsDNA抗体的血清浓度。4.统计分析用SPSS17.0软件进行结果的统计分析。数据用中位数±四分位距表示。PGRN的分布为非正态分布,采用非参数检验。糖皮质激素治疗前组和治疗后组数据的分析采用两个相关样本的非参数检验。实验组和对照组之间的数据分析采用两个独立样本的非参数检验。PGRN与IL-6, PR3/TNFR, TNF-α及抗dsDNA抗体之间的关系用斯皮尔曼等级相关进行分析。认为P<0.05差异具有统计学意义。研究结果1.研究对象的临床特点实验组的30例SLE患者中,男性7例,女性23例,年龄12-52岁,平均28.4±9.3岁。病程1-37月,平均12.6±10.1个月。实验组患者的SLEDAI评分,治疗前范围10-23分,平均15.1±3.8分,治疗后范围是6-22分,平均12.2±4.0分。对照组包括女性23例,男性7例,年龄在18-59岁之间,平均30.1岁。2.SLE患者外周血清中PGRN水平升高治疗前SLE患者外周血清中PGRN (17.82±5.18, p<0.01), IL-6(1.56±1.18, p<0.01), TNFR(17.50±10.33, p<0.01), TNF-α(89.59±20.27, p<0.01), PR3(49.33±18.85,p<0.01)和dsDNA抗体(208.19+194.24,p<0.01)的浓度均高于正常对照组。在SLEDAI评分≥10的SLE患者中,PGRN外周血清浓度显著升高(p<0.05)。治疗后SLE患者与治疗前SLE组相比,外周血清中PGRN浓度显著下降(13.64-±4.51,p=0.002)。治疗后SLE患者外周血清中PGRN浓度显著仍高于对照组人群(11.09±1.62,p=0.002)。总之,无论是治疗前还是治疗后SLE患者外周血清中PGRN的表达均高于正常对照人群。治疗后SLE患者外周血清中IL-6(0.97±0.37,p=0.001), TNFR(10.61±3.70,p=0.025)和TNF-α(54.31±17.17,p=0.012), PR3(48.25±10.89, p<0.01)浓度均高于对照组人群。治疗前IL-6, TNFR和TNF-α,浓度高于治疗后SLE患者(p<0.05)。PR3在治疗前和治疗后SLE患者中的表达差异无统计学意义p>0.05)。3.S1E患者PMBCs中PGRN mRNA高表达我们用与内参基因GAPDH比较后的倍数表示PGRN mRNA表达水平的变化。与对照组相比,治疗前SLE患者PGRN mRNA表达相对数值升高了4.4倍(P<0.01)(图1)。治疗后SLE患者与治疗前相比,PGRN mRNA表达相对数量下降了1.34倍(P<0.05)。4.激素治疗下调SLE患者的PGRN及其它炎症因子的表达水平在实验组中,经过GC治疗后,外周血清中PGRN(13.64±4.51, P=0.02),IL-6(0.97±0.37,P=0.022),TNFR(10.61±3.70,P=0.003),TNF-α(54.31±17.17, P=0.0011和anti-dsDNA抗体(137.02±80.71,P=0.038)的浓度明显下降。但是PR3无明显变化(48.25±10.89,P=0.549)。治疗后SLE患者与治疗前相比,PGRN mRNA表达相对数量下降了1.34倍(P<0.05)；同时IL-6(P<0.05)TNF-α(P<0.05)and TNFR(<0.05)mRNA表达亦明显下降。5.SLE患者PGRN与其它炎症反应因子的关系为了明确在SLE患者中PGRN表达水平与炎症反应因子之间的关系,我们用斯皮尔曼等级相关分析了PGRN与IL-6,TNFR,TNF-α,PR3和抗dsDNA抗体之间的相关性。结果显示,治疗前的SLE患者外周血清PGRN水平与IL-6(r=0.790,P<0.01),TNFR(r:0.559,P=0.01),TNF-α(r=0.438,P=0.015)和抗dsDNA抗体(r=0.906,P<0.01)具有显著相关性。经过GC治疗后,PGRN浓度仍与IL-6(r=0.836,P<0.01),PR3(r=0.396,P=0.031),TNFR(r=0.533,p=0.02), TNF-α(r=0.378,P=0.039)和抗dsDNA抗体(r=0.712,P<0.01)显著相关。但是治疗前组中,PGRN与PR3的浓度无显著相关性(r=0.298,P=0.110)。结论我们检测了PGRN在SLE患者外周血中的表达水平,初步探讨了PGRN在SLE的表达及意义。本研究结果得到以下的结论：(1).PGRN在活动性及稳定性SLE患者的外周血清中浓度显著高于健康对照人群,PMBC的mRNA的表达亦高于健康对照人群；(2).PGRN的受体TNFR, PR3, IL-6, TNF-α及抗dsDNA抗体在活动性狼疮患者中均高表达；(3).无论在治疗前还是治疗后SLE患者中PGRN的浓度与IL-6及抗dsDNA抗体浓度线性相关；(4).糖皮质激素可显著降低PGRN在SLE患者中的表达。总之,PGRN参与了SLE的发生发展过程,且浓度的高低与SLE的疾病活动性相关。我们认为PGRN作为TNF/TNFR的拮抗剂,可能是将来治疗SLE的一个强有力的新靶点。研究背景系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种多态性的自身免疫性疾病今病因不明。SLE多发生在20岁到40岁之间的妇女。SLE发病的病理特点是自身抗体的高表达和免疫复合物的沉积,常常累及机体的多个系统和器官。SLE的病因不明,其发病和遗传,环境的相互作用有关。自身免疫耐受平衡的打破导致了自身免疫性疾病的发生发展,SLE也不例外。IL-12家族包括IL-12, IL-23, IL-27和IL-35,它们都是异二聚体,具有调节免疫系统的多种生物学功能。IL-12是由p35和p40两个亚单位组成的异二聚体,对于Thl细胞的分化至关重要。IL-23由p40和p19两个亚单位组成。IL-12和IL-23是促炎症反应因子,分别调节Th1和Thl7细胞的发育。IL-27由EBI-3和p28两个亚单位组成,起初被认为是促炎症反应因子,最近发现它是一个免疫调节因子。IL-35是近年分离出的新的IL-12的家族成员,由EBI-3和p35组成,是强有力的抑炎因子,由胸腺来源的自然调节T细胞产生。糖皮质激素(Glucocorticoids, GCs)是强有力的抗炎和抑制免疫药物,广泛应用于治疗SLE,皮肌炎等自身免疫性疾病。糖皮质激素抑制白细胞向炎症反应部位迁移并通过调节基因表达破坏白细胞,成纤维细胞和内皮细胞的功能；可以明显减少促炎性细胞因子的表达,例如IL-2, IL-6, TNF-α和前列腺素(prostaglandins, PGs)。目前IL-12, IL-23, IL-27和IL-35在SLE患者疾病发生发展过程中的作用未知。在本研究中我们将探讨这些因子在SLE患者中的表达及糖皮质激素治疗对它们的影响。研究方法：2.研究对象筛选30例新诊断的且SLEDAI (systemic lupus erythematosus disease activity index)评分≥10的SLE患者进入实验组。他们的诊断均符合1997年美国风湿病学院修订的SLE的分类标准。所有的实验组患者入组前都未接受糖皮质激素及其它免疫抑制剂的治疗。入组后所有患者均接受了激素治疗,即泼尼松1mg/kg/day。连续给予泼尼松2周后再次采集外周血样。对照组包括30例年龄性别相匹配的健康成年人。所有研究对象均签署了山东大学齐鲁医院临床伦理委员会的知情同意书。2.酶联免疫吸附试验检测外周血清IL-12家族各因子的浓度在激素治疗前后分别收集5ml外周血,凝固后离心取得血清,储存在-80℃条件下。按照说明书用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测血清中IL-12, IL-23, IL-27, IL-35, IL-6和抗dsDNA抗体血清浓度。4.统计分析用SPSS17.0软件进行结果的统计分析。数据用中位数±四分位距表示。糖皮质激素治疗前组,治疗后组和对照组之间的数据分析采用非参数检验。IL-12家族各因子与IL-6和抗dsDNA抗体之间的关系用斯皮尔曼等级相关进行分析。认为P<0.05差异具有统计学意义。研究结果5.研究对象的临床特点实验组的30例SLE患者中,男性7例,女性23例,年龄13-52岁,平均28.4±9.4岁。病程1-37月,平均12.9±10.1个月。实验组患者的SLEDAI评分,治疗前范围10-23分,平均15.2±3.8分,治疗后范围是6-22分,平均12.4±4.0分。6.SLE患者外周血清中IL-12家族各因子水平升高,糖皮质激素治疗后下降结果显示,治疗前SLE患者外周血清中IL-12, IL-23, IL-27, IL-35, IL-6和抗dsDNA抗体的浓度均高于正常对照组(p<0.05)。治疗后,IL-12, IL-23, IL-27, IL-35, IL-6和抗dsDNA抗体的浓度明显下降,且IL-23, IL-27, and IL-35的水平与正常对照组无显著差异。3.SLE患者IL-12, IL-23, IL-27, IL-35与IL-6和抗dsDNA抗体的关系结果显示,治疗前的SLE患者外周血清IL-12水平与IL-6(r=0.897, P<0.01),和抗dsDNA抗体((r=0.607,P<0.01)具有显著相关性。经过GC治疗后,IL-12浓度仍与IL-6(r=0.897, P<0.01)和抗dsDNA抗体((r=0.651,P<0.01)显著相关。此外IL-23, IL-27, IL-35的水平分别与IL-6和抗dsDNA抗体水平呈显著相关性。结论我们的研究显示,IL-12家族各因子在SLE患者中高表达。IL-12与IL-23与疾病的活动性相关。因此我们需要更多的研究来明确IL-12, IL-23, IL-27和IL-35在SLE疾病的发生及发展中的作用,这将有助于我们发现新的治疗SLE的靶点。