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利用平板培养对多孔菌Y-30菌株进行了菌丝体固体培养的营养条件和pH条件研究。经过单因素筛选试验,结果表明:菌丝体培养的最佳碳源为玉米面,最佳氮源为蛋白胨,最适pH为6;无机盐试验中,加入KH2PO4时,生长速度最快,其次为MgSO4,但同时加入二者的菌丝生长状况最好;碳氮比为20/1和40/1时平均日生长速度相同,为防止菌丝过早老化,最终选择碳氮比为20/1;确定最佳培养基配方,对玉米面、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾四个因素进行正交试验,结果确定菌丝生长的最佳固体培养基配方为:玉米面3%,蛋白胨0.7%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%、蒸馏水1000ml、琼脂2%。
利用摇瓶培养对多孔菌Y-30菌株液体培养的营养条件进行了研究。通过检测培养过程中发酵液多糖、菌丝体多糖和菌丝体生物量三个指标,对液体培养的单因素进行筛选试验,结果表明,液体培养的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为牛肉膏,无机盐筛选时,MgSO4和KH2PO4在菌丝体生物量和多糖产量上都表现较好,因此,两种无机盐同时加入。最佳C/N为40/1。经过正交试验,确定多孔菌Y-30菌株的最佳液体培养配方为:蔗糖3%、牛肉膏0.5%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.03%、蒸馏水1000ml。
在初步确定液体培养的最佳培养基配条件下,通过单因素试验和正交试验,研究了多孔菌Y-30菌株液态发酵工艺条件对多糖产量和菌丝体生物量的影响。单因素试验结果表明:最佳的液体种子种龄、起始pH、温度、装瓶量、接种量和转速依次为,6d、自然pH(6.7)、25℃、200ml、10%和180r/min。对pH、接种量和温度三个因素进行了正交试验,结果显示:以胞外多糖产量为依据,最优组合为pH6.7、接种量10%、温度25℃;以胞内多糖为依据,最优组合为pH6.3、接种量10%、温度27℃。在胞外多糖产量依据的最优组合下进行了发酵试验,并跟踪检测了发酵液pH、黏度、ECP、ICP和菌丝体生物量的变化。
采用热水浸提法,通过单因素试验和正交试验,研究了提取温度、时间、料水比、提取液pH、提取次数、乙醇用量对菌丝体多糖得率的影响。单因素试验结果表明:菌丝体多糖提取的最佳温度、时间、料水比、pH、提取次数和乙醇用量分别为,90℃、2.5h、1/30、11、2次和4倍体积;在固定pH11,提取次数2次的条件下,对提取温度、时间和料水比三个因素的正交试验,结果:提取的最佳组合为,提取温度90℃、时间2h、料水比1/30,得到的菌丝体多糖含量为2.21mg/mg。
将分级得到的菌丝体多糖、发酵液多糖和多糖-5-氟尿嘧啶联合组进行体外抗肿瘤试验,结果显示:对于MDA细胞,D1、E3、J3、联合组D、E、F、J都表现出了较好的抑瘤效果,分别为70.19%、64.62%、69.02%、88.39%、89.47%、93.47%。