研究背景子宫内膜恶性肿瘤是由子宫内膜细胞异常增生所致,其种类繁多且绝大多数是源于腺上皮的子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC),其中最常见的类型是子宫内膜腺癌(endometrial adenocarcinoma,EAC)。子宫内膜癌是发达国家和地区女性生殖系统肿瘤中最常见的一种,也是继卵巢癌、宫颈癌后恶性肿瘤导致女性死亡的第三大原因。子宫内膜癌的主要症状是异常的阴道出血,除此之外的临床表现(如盆腔疼痛等)并不明显,因此无明显症状的子宫内膜癌早期不易发现。环境和遗传因素在子宫内膜癌的发生发展中具有重要的作用。一般认为,长期暴露于缺乏孕激素拮抗雌激素作用的环境中将增加子宫内膜非典型增生以及子宫内膜癌发生的机会,因此如肥胖、糖尿病、三苯氧胺(TAM)治疗乳腺癌、未生育及绝经延迟等可增加雌激素相对水平的原因均是子宫内膜癌的危险因素。此外,遗传因素(包括一些癌基因或抑癌基因的突变)也是导致子宫内膜癌发生及治疗抵抗的重要原因。子宫内膜癌中最常见的是由PTEN/PIK3CA基因突变导致的PI3K/Akt通路的过度活化,在促进肿瘤细胞的存活、增殖以及治疗抵抗中发挥重要作用。子宫内膜活检联合经阴道超声是子宫内膜癌诊断的标准,而对组织内雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和细胞增殖核抗原(Ki-67)等分子水平的检测则有助于预测子宫内膜癌的发生发展及预后情况。目前,临床治疗子宫内膜癌的方法主要是根治性子宫全切术(包括子宫颈、双侧输卵管和卵巢)并辅以放化疗或内分泌治疗,然而由于原发或获得性耐药,致使子宫内膜癌患者的5年生存率多年未得到进一步改善。因此,探索新的分子生物学指标以及基因治疗的靶基因是改善子宫内膜癌预后的关键。FKBP51蛋白(FK506-binding protein 51)是免疫亲和蛋白家族中的一员,其表达水平可受类固醇激素(糖皮质激素、雄激素和孕激素)诱导而明显上调,并且在多种生物学过程中发挥重要的调控作用,包括蛋白质的折叠和转运、类固醇激素受体(GR、AR、PR)复合物的形成等。此外,FKBP51还可通过不同的信号通路(主要为Akt、NF-κB)调节肿瘤的发生发展及其对放化疗的敏感性。如前所述,子宫内膜癌是与类固醇激素(雌激素、孕激素)以及Akt通路活性密切相关的肿瘤性疾病,FKBP51是否在子宫内膜癌的发生发展中发挥作用,目前尚未有相关的报道。除此之外,FKBP51能否成为基因治疗的靶点而影响子宫内膜癌对药物的敏感性也是值得我们深入研究的问题。为明确FKBP51在子宫内膜癌的发生发展和对药物反应性中的作用及其作用的机制,为子宫内膜癌的临床治疗提供新的实验基础,本课题从以下三个部分进行研究:第一部分FKBP51在人子宫内膜组织中的表达及其临床意义1.目的:检测人子宫内膜腺癌和正常子宫内膜组织中FKBP51蛋白的表达水平,探讨FKBP51表达水平与临床病理特征的关联性。2.方法:(1)样本收集:98例腺癌和97正常对照组子宫内膜标本源于陕西超英生物科技有限公司和山东大学附属省立医院妇科,其中对照子宫内膜组织中50例为增殖期内膜,47例为分泌期内膜。所有患者在术前均未接受任何形式的治疗(包括手术、放化疗或者内分泌治疗)。本研究通过了伦理审查委员会的批准,并在获得患者知情同意后收集样本。(2)免疫组化:用免疫组织化学方法检测正常子宫内膜和子宫内膜腺癌组织样本中FKBP51蛋白的表达。染色结果由两名病理科医生独立进行评分,并用Image-Pro Plus图像分析软件来获取每张图片染色区域的平均光密度值(AOD)。(3)统计处理:用统计软件SPSS分析FKBP51在子宫内膜组织中的缺失率和AOD值,若p<0.05则认为差异具有统计学意义。3.结果:子宫内膜腺癌的发生主要是由于孕激素水平的相对不足;并且,在正常月经周期中,增殖期孕激素的水平也明显低于分泌期。研究表明,孕激素可显著诱导FKBP51的表达,则FKBP51在孕激素水平相对较低的子宫内膜腺癌和正常增生期子宫内膜中的表达水平应低于其在正常分泌期子宫内膜中的水平。这一推测与我们的结果一致:(1)子宫内膜腺癌中FKBP51蛋白的表达明显低于对照子宫内膜,且表达的缺失率升高。(2)FKBP51的表达水平与子宫内膜腺癌的组织学分级或临床分期未发现相关。(3)正常增殖期子宫内膜组织中FKBP51蛋白的表达水平明显低于正常分泌期子宫内膜组织中的水平,且缺失率升高。(4)FKBP51的表达随着患者年龄的增长发生变化,呈先上升后持续衰减的趋势,与体内孕激素水平的变化相一致,进一步证实了 FKBP51是与孕激素密切相关的蛋白。4.结论:本研究通过免疫组化的方法发现,子宫内膜腺癌组织中FKBP51的水平<正常增殖期子宫内膜组织中FKBP51的水平<正常分泌期子宫内膜组织中FKBP51的水平。推测与孕激素密切相关的FKBP51可能参与子宫内膜腺癌的发生发展。第二部分FKBP51对子宫内膜腺癌细胞生物学行为的影响及其机制1.目的:研究FKBP51对子宫内膜腺癌细胞恶性行为的影响,并探讨其作用的机制。2.方法:(1)建立稳转细胞系选出相对高表达和低表达FKBP51蛋白的两种人子宫内膜腺癌细胞系:KLE、Ishikawa。将构建有shRNA-FKBP51的质粒转染至KLE细胞中,并用Puromycin筛选的方法建立稳定干扰FKBP51表达的单克隆细胞系shR-FKBP51和对照细胞系shR-Ctrl;另外,用构建有野生型FKBP51 cDNA的慢病毒表达载体感染Ishikawa细胞并建立FKBP51稳定表达的细胞系LV-FKBP51和对照细胞系LV-Vec。用免疫印迹法Western Blot检测转染后细胞中FKBP51的表达,检验干扰和过表达效率。(2)细胞增殖能力检测用实时无标记细胞分析法(RTCA)检测FKBP51对子宫内膜腺癌细胞系增殖能力的影响。(3)细胞周期和凋亡检测用流式细胞分析术检测FKBP51对细胞系周期分布和凋亡率的影响。(4)细胞侵袭性检测用Transwell法检测FKBP51对细胞系侵袭性的影响。(5)Akt通路分子检测用Western Blot检测细胞系中Akt(Ser473、Thr308)位点的磷酸化水平,总Akt水平以及Akt信号通路下游分子的水平:包括GSK3β(Ser9)位点的磷酸化水平及FOXO1、p21、p27和p53的水平,以此探究FKBP51对Akt通路活性的影响。(6)Akt活性检测用Akt激酶活性检测试剂盒验证FKBP51对Akt激酶活性的影响。(7)抑制Akt通路后细胞增殖能力的检测向KLE细胞系shR-Ctrl和shR-FKBP51中分别加入DMSO或不同浓度的Akt特异性抑制剂MK-2206作用0、24、48和72小时后,用CCK-8法检测FKBP51对两组细胞增殖能力的影响有无变化。(8)NF-κB通路分子检测用Western Blot检测细胞系中p65(Ser536)位点的磷酸化水平以及IκB的水平,以此反应FKBP51对NF-κB通路活性的影响。(9)ER、PR表达检测用Western Blot检测转染后的Ishikawa细胞中ER、PR水平的变化。3.结果:(1)获得稳转细胞系经过Western Blot的鉴定,确认建立稳定干扰表达和过表达 FKBP51 的细胞系 KLEshR-FKBP51、IshikawaLV-FKBP51,及其各自的对照细胞系 KLE shR-Ctrl 和 IshikawaLV-Vec。(2)FKBP51抑制细胞的增殖通过RTCA法检测细胞的增殖能力发现,与各自对照细胞系相比,KLE shR-FKBP51的增殖能力明显升高(p<0.05),而Ishikawa LV-FKBP51的增殖能力则显著降低(p<0.01),说明FKBP51能抑制子宫内膜腺癌细胞的恶性增殖能力。(3)FKBP51不影响细胞的凋亡或侵袭性流式细胞分析实验和Transwell实验证实,干扰表达或过表达FKBP51后细胞的凋亡率和侵袭性与对照细胞系相比均无明显差异(p>0.05,p>0.05)。(4)FKBP51诱导细胞周期阻滞细胞周期实验结果显示,KLEshR-FKBP51的G0/GI期细胞数目显著减少(p<0.001),G2/M期细胞数明显增加(p<0.01),且细胞增殖指数(G2/M+S)升高(p<0.001);而 IshikawaLV-FKBP51 的 G0/G1期细胞数则增多(p<0.05),G2/M期细胞数显著减少(p<0.01),且细胞增殖指数降低(p<0.01)。证实FKBP51通过诱导细胞周期阻滞于G0/G1期而抑制子宫内膜腺癌细胞的增殖能力。(5)FKBP51 降低 Akt 的磷酸化水平 Western Blot 结果显示,KLE shR-FKBP51细胞内Akt(Ser473)位点的磷酸化水平升高(p<0.01),而IshikawaLV-FKBP51的Akt(Ser473)位点磷酸化水平降低(p<0.01),同时两组细胞Akt(Thr308)位点的磷酸化水平均无明显差异。提示FKBP51能够特异性地降低Akt(Ser473)位点的磷酸化水平。(6)FKBP51减弱Akt激酶的活性通过对Akt激酶的活性进行检测发现,KLE shR-FKBP51细胞内Akt激酶对底物GSK-3α的磷酸化作用增强(p<0.01),而Ishikawa LV-FKBP51中Akt对GSK-3α的磷酸化作用则减弱(p<0.01),证实FKBP51对Akt激酶活性的抑制作用。(7)FKBP51调控Akt通路下游分子的水平Western Blot结果显示,KLE shR-FKBP51细胞GSK3β(Ser9)位点的磷酸化水平升高(p<0.01),细胞周期抑制分子 p21、p27 和 p53 的水平降低(p<0.001);而 IshikawaLV-FKBP51 细胞GSK3β(Ser9)位点的磷酸化水平降低(p<0.01),p21、p27和p53的水平增加(p<0.001)。证实FKBP51抑制Akt通路的活性,也提示FKBP51通过削弱Akt信号通路的活性,增加周期抑制分子水平的表达,从而诱导周期阻滞并最终抑制细胞的增殖。(8)Akt抑制剂可逆转因下调FKBP51表达所致的促细胞增殖作用在KLE shR-FKBP51和对照细胞系KLE shR-Ctrl中加入不同浓度的Akt抑制剂MK-2206后发现,随着MK-2206浓度的增加,KLE shR-FKBP51与KLE shR-Ctrl之间增殖能力的差异逐渐缩小直至无差别。证实FKBP51是通过Akt信号通路调控细胞的增殖。(9)FKBP51不影响NF-κB信号通路的活化Western Blot结果显示,干扰表达或过表达FKBP51后,细胞内IκB的降解以及p65(Ser536)位点的磷酸化水平均无明显差异,表明FKBP51并不影响NF-κB信号通路的活化。(10)FKBP51不影响ER的水平Western Blot结果显示,FKBP51不影响ER、PR的表达。提示FKBP51可能并非通过ER或PR通路抑制子宫内膜腺癌细胞的增殖。4.结论:FKBP51通过降低Akt(Ser473)位点的磷酸化水平,削弱Akt激酶的活性,诱导细胞周期阻滞,抑制子宫内膜腺癌细胞的增殖。第三部分FKBP51对子宫内膜腺癌化疗及内分泌治疗敏感性的影响及机制1.目的:研究FKBP51在子宫内膜腺癌细胞的化疗、孕激素治疗反应性中的作用,并探讨其作用的机制。2.方法:(1)FKBP51对细胞化疗敏感性的影响向转染后的两组细胞系KLE和Ishikawa中分别加入不同浓度的紫杉醇(PTX)、顺铂(DDP),并用CCK-8法检测细胞的存活率。(2)建立稳转细胞系由于KLE细胞缺乏孕激素受体(PR),因此除已建好的过表达FKBP51的Ishikawa细胞系外,另选一株PR阳性的RL95-2细胞,将构建有shRNA-FKBP51的质粒转染至RL95-2细胞中,并用Puromycin筛选的方法建立稳定干扰FKBP51表达的单克隆细胞系shR-FKBP51和对照细胞系shR-Ctrl。(3)FKBP51对细胞孕激素敏感性的影响向RL95-2和Ishikawa两组细胞系中分别加入DMSO或不同浓度的孕激素制剂(醋酸甲羟孕酮,MPA),并用CCK-8法检测细胞的存活率。(4)FKBP51对孕激素调控的相关分子水平的影响用Western Blot检测细胞系中MPA调控的ER、雌二醇脱氢酶(HSD-17β2)、p21、p27和p53的水平。(5)Akt通路在FKBP51增强MPA敏感性中的作用:a.检测Akt的磷酸化水平在DMSO或MPA的作用下,用Western Blot检测细胞系中磷酸化Akt的水平。b抑制Akt通路后,检测细胞对孕激素治疗的敏感性在MPA的作用下,向转染后的RL95-2细胞系中加入不同浓度的MK-2206,用CCK-8法检测细胞的存活率。c.抑制Akt通路后,检测孕激素相关分子的水平在MPA的作用下,向转染后的RL95-2细胞系中加入MK-2206,用Western Blot检测PR、p21的水平。(6)FKBP51对PR水平的影响向转染后的RL95-2细胞系中加入DMSO或MPA,用Western Blot检测FKBP51、PR的水平。3.结果:(1)FKBP51不影响细胞对化疗的敏感性药敏实验结果表明,干扰表达或过表达FKBP51后,细胞对化疗药物的敏感性与对照细胞系相比均无明显差异(p>0.05,p>0.05)。(2)PR阳性稳转细胞系的建立通过Western Blot的鉴定,确认建立稳定干扰表达和过表达FKBP51的PR阳性细胞系RL95-2 shR-FKBP51、Ishikawa LV-FKBP51,及其各自的对照细胞系 RL95-2 shR-Ctrl 和 Ishikawa LV-Vec。(3)FKBP51增强细胞对孕激素的敏感性与各自对照细胞系相比,RL95-2 shR-FKBP51的细胞存活率及半数抑制浓度(IC50)明显升高(p<0.01,p<0.01);而Ishikawa LV-FKBP51的细胞存活率和半数抑制浓度(IC50)则显著降低(p<0.01,p<0.01)。表明FKBP51能增强子宫内膜腺癌细胞对孕激素的敏感性。(4)FKBP51促进孕激素诱导的周期抑制分子的表达在MPA的作用下,干扰表达或过表达FKBP51对ER和HSD-17β2的水平均无影响。而RL95-2 shR-FKBP51 中 p21、p27 和 p53 的水平低于对照细胞系(p<0.01),Ishikawa LV-FKBP51的p21、p27和p53的水平则显著高于对照细胞系(p<0.01)。证实FKBP51能促进了孕激素对周期抑制分子的诱导作用。(5)FKBP51通过降低Akt的磷酸化水平增强细胞对MPA的敏感性a.FKBP51降低Akt磷酸化水平Western Blot结果显示,无论细胞是否经过MPA处理,RL95-2 shR-FKBP51胞内Akt(Ser473)位点的磷酸化水平均升高(p<0.01),而IshikawaLV-FKBP51的Akt(Ser473)位点磷酸化水平均降低(p<0.01),且升高或降低的程度并无差异。提示MPA并不影响FKBP51对Akt磷酸化的抑制作用。b Akt抑制剂可逆转因下调表达FKBP51所致的细胞对孕激素敏感性降低药敏实验结果表明,随着MK-2206浓度的增加,RL95-2shR-FKBP51与对照细胞系之间对MPA敏感性的差异逐渐缩小直至无差别。c.Akt抑制剂可逆转因下调表达FKBP51所致的周期抑制分子水平的降低Western Blot结果显示在MPA的作用下,随着MK-2206浓度的增加,RL95-2shR-FKBP51与对照细胞系中p21的水平逐渐升高,且二者之间的差异也而逐渐缩小直至无差别。说明FKBP51通过抑制Akt通路提高周期抑制分子的水平,进而增强细胞对MPA的敏感性。(6)FKBP51不影响PR的表达a.MPA促进FKBP51的表达。经MPA处理的RL95-2和Ishikawa细胞系中,FKBP51的水平均高于未经MPA处理组。这证实了孕激素对FKBP51表达的诱导作用。b FKBP51不影响PR的水平经MPA处理的RL95-2和Ishikawa细胞系中,PR的水平均高于未经MPA处理组。这证实了孕激素对PR表达的诱导作用,但转染组和空载体组之间无差异,说明FKBP51不影响PR的水平。4.结论:FKBP51通过降低Akt通路的活性,进一步上调周期抑制分子的表达,增强子宫内膜腺癌细胞对MPA的敏感性。