嗜热β-葡萄糖苷酶重组表达及纤维二糖水解特征研究

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生物质能源作为新型的可再生能源,其发展对于缓解化石能源枯竭危机、减少日益严重的环境污染具有极其重要的意义。将纤维素类生物质转化为乙醇等其他能源产品是生物质能源发展的一个重要研究方向。但是,木质纤维素的高效转化利用仍然面临着很多挑战,其中一个重要问题是生物转化过程中所需纤维素酶的生产成本太高。通过基因工程手段,获得性能较佳的产业化纤维素酶可以显著降低纤维素乙醇的生产成本。我们知道,β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系的限速酶,它决定着纤维素酶整体活力的高低;与温和型β-葡萄糖苷酶相比,嗜热型在工业应用中具有明显的产业化应用优势。然而,产嗜热β-葡萄糖苷酶的极端微生物生长所需的条件一般难以达到,所以,目前通过采用基因工程手段,实现异源表达嗜热β-葡萄糖苷酶已成为各国的研究热点之一。激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)作为绝对厌氧的极端嗜热微生物,其产生的β-葡萄糖苷酶可能是日前热稳定性和酶活最好的β-糖苷键水解酶之一。因此,本研究利用大肠杆菌E.coli Rosetta重组表达该嗜热β-葡萄糖苷酶基因,激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)嗜热β-葡萄糖苷酶基因的成功表达及其活性包涵体的成功发现,对于推进木质纤维素的高效生物转化及酶制剂工业化生产将具有重要意义。主要研究结果归纳如下:  1)本论文以Pyrococcusfuriosus的基因组DNA为模板,通过PCR获得了嗜热β-葡萄糖苷酶基因,将其与表达载体pET24a(+)连接,成功构建了重组表达质粒pET24a(+)-PF0073。  2)将该重组表达质粒转化到大肠杆菌E.coli Rosetta中得到成功表达,优化其诱导表达条件后对其水解纤维二糖的酶学性质进行表征。得出,该重组β-葡萄糖苷酶的最适pH和温度为5.0和95℃,在pH4.0-8.0和80-90℃范围内,具有较好的pH稳定性和热稳定性。该重组β-葡萄糖苷酶的比酶活为222.94 U/mg,动力学常数Km值为16.9 mM,Vmax为0.6279μM/min。1mM的金属离子(如Li+、Ca2+、Co2+等)和10mM的EDTA以及糠醛对其活性影响不大,其对乙醇的耐受性良好, Ki值达到150g/L,对葡萄糖的耐受性略差,Ki值为200mM。  3)本研究发现,重组蛋白表达过程中形成具有水解纤维二糖能力的活性包涵体(BGL-AIBs)。在37℃和25℃条件下对BGL-AIBs的诱导表达条件进行优化,得出两个温度下的最佳诱导表达条件均为OD600为1.2、诱导时间为14h、IPTG浓度为0.25mM,且两者相比37℃时BGL-AIBs的表达水平更高。然后初步研究BGL-AIBs的性质与结构特征。结果表明其基本酶学性质与重组β-葡萄糖苷酶的相似,特殊的是,BGL-AIBs具有很好的重复利用特性,重复使用6次后其酶活还保留86.6%。BGL-AIBs为松散型包涵体,且其在约1620nm处具有β-折叠结构。
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