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粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)是生长因子家族的一员,主要功能是刺激定向祖细胞向中性粒细胞分化。自上世纪九十年代开始应用于临床,主要用于减少癌症病人化疗后粒细胞减少后引起的感染,治疗严重的先天性粒细胞减少症。目前的临床研究表明,G-CSF是副作用很少,非常安全的一种药物。G-CSF对包括神经细胞在内的多种细胞也有营养作用。最近的研究表明,G-CSF有神经保护作用,但是G-CSF的神经保护作用的具体分子机制仍不明确。本研究组和国外的一些研究发现,在大鼠脑许多区域的神经细胞上都有粒细胞集落刺激因子受体(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSFR)的表达。研究表明,在啮齿类的中枢系统中,发生大脑中动脉梗塞和再灌注损伤时,神经细胞上G-CSF和G-CSFR的表达会上调。最近的研究发现,G-CSFR在不同发育程度的大鼠胚胎中枢神经系统的多个区域均有表达,并且在神经前体细胞和胶质前体细胞上均有表达,这表明G-CSF在神经发育过程中可能有非常重要的作用。但是,G-CSF对神经干细胞有没有作用,有什么样的作用,以及其可能的机制是什么,至今尚未见报道。近年来关于G-CSF神经保护作用的研究成果主要集中在两方面：G-CSF能动员CD34+的造血干细胞从骨髓迁移到外周血,显著减少梗死的区域和提高存活率；G-CSF通过调节凋亡相关蛋白的表达抑制细胞凋亡。关于G-CSF是否可能通过动员内源性NSCs的增殖从而促进脑损伤的修复未见相关报道。因此,我们首先在体外分离培养神经干细胞,采用免疫荧光、Western blot等技术方法,研究G-CSF对神经干细胞的作用及作用机制。在此基础上,建立了缺血缺氧性脑损伤模型,检测G-CSF对内源性神经干细胞的作用,从而为临床上应用G-CSF治疗神经损伤相关疾病提供了新的理论依据。一、体外研究G-CSF对神经干细胞的作用于小鼠妊娠后12.5天,应用体视显微镜成功分离胚胎神经管前端脑泡,经机械吹打获取细胞悬液,接种于无血清培养基,获得神经干细胞(neural stemcells, NSCs)。应用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU)标记以及巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色技术检测其增殖和更新能力,采用神经元特异性微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2, MAP2)和神经胶质细胞特异性胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)免疫荧光染色法检测了其分化情况。实验结果显示,获得的是具有增殖能力和分化潜能的NSCs,可以用于后续实验研究。我们首先用免疫荧光和RT-PCR方法检测了G-CSFR是否在NSCs表达,之后通过MTT分析法检测了G-CSF对NSCs活性的影响,结果显示,G-CSF可提高NSCs的增值活性,而且该作用呈现一定的剂量依赖关系,当G-CSF的浓度为100 ng／ml时,细胞的活性最高。后续采用此浓度研究了G-CSF对NSCs的增殖和分化作用。研究发现,G-CSF处理组的细胞增殖率明显高于对照组。说明G-CSF能促进NSCs的增殖。我们还用低浓度FBS的培养基中研究,研究了G-CSF对NSCs分化的影响,结果显示,G-CSF能促进NSCs的分化,尤其在培养后第三天和第五天表现更为显著。二、G-CSF促进NSCs增殖和分化机制的研究分别在G-CSF加入后5、15、30、60和75 min收集细胞,用Western blot方法研究STAT3和p-STAT3蛋白的表达状况。结果显示,STAT3的表达在所有时间点未发生明显变化,而活化型STAT3即p-STAT3的表达则在5 min开始升高,至30 min到达峰值,之后开始下降,至75 min接近正常水平。这表明,G-CSF与NSCs表面相应受体结合,能诱导STAT3的快速活化。加入G-CSFR的抗体后,p-STAT3的活化水平和细胞的增殖率均明显低于单纯G-CSF作用组,而和对照组水平接近。提示STAT3的活化参与了G-CSF对NSCs增殖的促进作为了研究G-CSF对NSCs分化的可能机制,我们应用RT-PCR方法检测了与NSCs分化密切相关的bHLH家族主要转录因子的表达变化,结果显示,Neurogl、NeuroD2、Mash1、Id1和Hes5的mRNA水平与对照组相比均有显著升高。其中Neurog1、NeuroD2、Mash1和Id1四个转录因子不仅mRNA水平高于对照,并且在G-CSF处理组的峰值均比对照组提前出现。更有趣的是,我们应用免疫荧光、Western blot和RT-PCR等方法研究发现在无FBS存在时,G-CSF不能独立启动NSCs的分化。三、缺血缺氧性脑损伤模型的建立及G-CSF神经保护作用的研究以往的研究显示,G-CSF有神经保护作用,但其分子机制不明。本研究采用新生小鼠单侧颈总动脉永久性结扎后给予低浓度氧气的方法,建立稳定的缺血缺氧性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage, HIBD)模型。结果显示,G-CSF治疗组同侧脑含水量明显低于HIBD组,海马区神经元的排列也较HIBD组规则,凋亡分析发现,G-CSF治疗组的细胞凋亡显著低于HIBD组,这与其他研究者的实验结果一致。在关于受体表达研究中,G-CSF治疗组G-CSF-R的表达与MAP2共定位,且表达显著高于HIBD组,说明G-CSF可促进神经元上G-CSFR的表达。为了探讨G-CSF抑制细胞凋亡的机制,我们检测了Bcl-2、Bax和Caspase3的蛋白表达,结果显示,G-CSF处理组Cleaved caspase 3和Bax的表达水平明显低于HIBD组而Bcl-2却明显高于HIBD组,提示Caspase3、bax和Bcl-2共同参与了G-CSF对HIBD后脑细胞的抗凋亡作用。四、G-CSF促进内源性NSCs的增殖的实验研究为了探讨G-CSF在缺血缺氧性脑损伤中对内源性NSCs的作用,我们分别检测了大脑半球皮质、海马、齿状回(Dentate gyrus, DG)和室管膜下区(Subven tricular zone, SVZ)等区nestin的表达,G-CSF-R的表达以及海马DG区和SVZ区细胞增殖的情况。结果显示,G-CSF显著促进nestin在大脑半球皮质,海马、DG和SVZ区的表达,并且G-CSF在HIBD处理后较长时间仍能维持SVZ区nestin的高水平表达,这可能是G-CSF对缺血缺氧性后小鼠脑有保护作用的机制之一。海马的DG区nestin和BrdU的双标结果及SVZ区的BrdU免疫荧光结果显示,G-CSF可促进NSCs的增殖。结论：G-CSF能促进外培养的NSCs的存活,并表现出一定的剂量依赖性。G-CSF能促进NSCs的增殖,并上调p-STAT3的蛋白表达。G-CSF能调节NSCs分化相关基因的表达,促进神经元和神经胶质细胞的分化。在HIBD模型中,G-CSF能通过调节凋亡相关蛋白的表达减少神经元的凋亡。同时,G-CSF能促进SVZ和DG等区内源性NSCs的增殖,这可能为G-CSF治疗神经损伤相关疾病的临床应用提供新的思路。同时,此项工作为G-CSF的神经保护作用提供了新的重要的理论支持。