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目的:CRISPR-Cas9编辑系统的开发已经开创了基因编辑的新纪元,在生物学,医学,农业和其他领域都有广泛的应用。但Cas9核酸酶在细胞内的过表达会引起脱靶效应,并可能在体内触发免疫反应。为了控制Cas9蛋白在胞内持续表达,实现“适量就好”的Cas9蛋白表达模式,我们构建了一种“自我调控型CRISPR系统”,实现在不改变靶基因编辑效率前提下,降低脱靶效应。方法:我们选取程序性死亡受体1基因(PD-1)为靶基因,对实验室已有的基因编辑质粒pX458-s3质粒(含有识别PD-1基因gRNA序列)进行改造,选取紧邻Cas9基因CAG启动子两端的两个酶切位点(Age I和Kpn I),分别在这两个酶切位点插入与靶基因gRNA的一致序列,构建出自我调控型基因编辑系统(SR-CRISPR质粒)。我们将SR-CRISPR质粒转染HEK293T细胞,少量表达的Cas9蛋白与靶向PD-1基因的gRNA形成Cas9-gRNA蛋白复合物,在切割靶位点PD-1基因同时,可以识别Cas9基因启动子两端插入的gRNA识别序列并进行切割,导致启动子被切除,终止Cas9基因的转录,抑制Cas9蛋白过量表达,从而降低由Cas9蛋白过量表达而造成的脱靶效应。为了验证“自我调控型CRISPR系统”在不降低编辑效应的同时,可以减少脱靶效应,我们将pX458-s3质粒(传统CRISPR)和SR-CRISPR质粒(“自我调控型CRISPR”)分别转染HEK293T细胞,进行以下实验。一、共聚焦显微镜观察EGFP的表达情况,分析两者胞内荧光密度差异。二、提取转染后不同时间点(12h,18h,24h,48h,60h)细胞总RNA和蛋白,通过Real time PCR和Western blot检测Cas9基因表达。三、针对启动子的切割位点设计引物,进行Real Time PCR和高通量测序,分析启动子的切割效率和Indel情况。四、转染60h后提取基因组,针对靶基因及可能脱靶位点的切割位点两侧设计引物,进行PCR建库,并利用高通量测序分析针对靶基因及脱靶位点的编辑效率(脱靶效率)。结果:在转染细胞后的60h,SR-CRISPR组的Cas9蛋白表达量仅为野生型系统的10%,启动子切割效率约为70%,SR-CRISPR系统针对靶基因编辑效率和同源重组效率分别约为50%和30%,与传统CRISPR组的编辑效率无显著性差异;本文通过实验确认了一个脱靶位点,相比传统CRISPR系统,SR-CRISPR系统针对该脱靶位点的Indel频率降低了76.7%,Indel的类型也明显减少(从传统CRISPR组的13类减少到2类)。结论:SR-CRISPR系统可以减少Cas9蛋白过表达,与野生型系统相比,SR-CRISPR系统针对靶基因的编辑效率不会改变,而脱靶效率显著降低。