雄激素是主要由睾丸间质细胞合成分泌的类固醇激素,其生理作用是影响胚胎的发育、维持生精功能、刺激生殖器官生长发育、促进男性第二性征出现、维持性欲等。除此之外,脑内的海马组织也能自身合成雄激素,而且脑内雄激素的水平高于循环血液中雄激素的水平,由此许多学者关注到雄激素的神经保护作用。目前大量研究表明,雄激素的脑保护作用主要体现在以下几方面:调节脑的发育、性别二态性、学习记忆、认知功能以及情绪,增强细胞活力,对抗氧化应激、血清剥夺,或者Aβ等造成的损害等等。本实验着重研究雄激素对突触可塑性的调节作用。流行病学资料也表明,随着年龄增长,雄激素水平降低,相应的脑的学习认知能力会逐渐减退。故而,认为年龄相关的雄激素水平减低是老年男性发生阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的一个重要危险因素。我们的之前的研究也已经证明,去势引起的雄激素水平下降可以影响SAMP8小鼠海马的突触可塑性,损害学习记忆的能力,导致认知功能障碍。雄激素补充治疗则可以逆转这些改变。因此,研究一定剂量的雄激素能否维持突触可塑性的正常,将对于深入理解年龄相关的雄激素水平减低导致AD发生具有十分重要的意义。像其它甾体类激素一样,雄激素发挥其生理功能有两条途径。一是经典的基因组途径。甾体类激素自由穿过细胞膜,到达胞质,特异性的激活并结合到细胞内的类固醇受体蛋白质,结合激素的类固醇受体以二聚体或异二聚体的形式再与位于靶基因启动子上特异的DNA反应元件作用,从而激活或抑制转录过程以及后续的蛋白质合成。二是快速的非经典途径。非基因组机制至少应该具备以下特征之一:(1)作用速度较快,常在数秒钟或数分钟内完成;(2)胞膜介导;(3)不被经典的雄激素受体拮抗剂氟他胺所阻断(除非拮抗剂具有的结构与雄激素胞膜结合位点相关,是雄激素基因组和非基因组受体共同的部分);(4)无直接转录/翻译机制的激活,即使在有DNA转录抑制剂和蛋白质合成抑制剂存在的情况下,也能发挥作用。已有研究表明,雄激素可以通过快速的非基因组途径调节突触的结构可塑性。我们前期的研究也证明,海马神经元的胞膜上存在着雄激素特异性的结合位点。本实验设计使用不透过细胞膜的睾酮-牛血清白蛋白大分子复合物作用于原代海马神经元,观察其对突触引起的一系列变化,以证实这些影响是通过细胞膜受体介导而完成的。另外观察经典的雄激素核受体拮抗剂氟他胺能否阻断由睾酮引发的海马神经元突触的一系列改变。之前关于适时适量雄激素促进树突棘生长的研究多是整体和组织水平的,而鲜有细胞层面上的实验报道。本课题采用原代培养的海马神经元为研究对象,观察睾酮在短时间(1h)内引起的神经元树突棘密度的变化。与动物模型相比,体外培养的原代神经元具有影响因素单一、机体干扰因素少和实验条件易控制等优点。而且,原代培养的海马神经元的发育阶段、相互作用、形态特征以及各种突触蛋白的表达模式和定位等生物学特征与在体神经元基本相同,在一定程度上能够代表在体神经元的生理和病理状态。本实验从观察对象上进一步完善了雄激素快速调节树突棘生长的理论体系,对深入理解雄激素发挥生理作用的方式有一定的帮助。突触相关蛋白在维持突触正常的功能中发挥着重要的作用。突触前终末的活性区聚集了充满神经递质的突触囊泡。在神经递质释放的过程中,突触囊泡的活动受到突触前蛋白及其复合体相互作用的调节。突触素(synaptophysin,syn)是一种位于突触囊泡膜上的整合蛋白,在中枢神经、周围神经以及神经内分泌细胞上均有广泛表达,也是胞质内ca2+在突触囊泡上的结合位点,参与突触囊泡膜与突触前膜的融合和神经递质的释放,为突触终末特异性标记物。其分布数量和密度可间接反映突触的数量和密度,是突触可塑性一个重要的参考指标。兴奋性突触的突触后膜,在电镜下呈现一增厚的突触后致密带(postsynapticdensity,psd),是由神经递质受体、信号转导蛋白和细胞骨架蛋白等组成的复合物。具有一系列的突触相关功能,比如调控离子通道、活化突触和参与细胞内信号转导等。psd95是psd中含量最丰富的蛋白之一,其负责的装配和组织作用在突触后信号转导系统中居于核心位置。它还与n-甲基-d-天门冬氨酸受体的调节亚基及其相关的信号蛋白相作用,参与信息的存储过程。目前psd95已被广泛用作突触后特异性标志物,是突触可塑性的另一重要指标。n-甲基-d-天门冬氨酸(n-methyl-d-aspartate,nmda)受体是一种谷氨酸能的钙离子电压门控通道,能够选择性的被nmda或谷氨酸激活,在中枢神经系统中的功能是调节兴奋性神经递质的传递。因此nmda受体与学习、记忆等活动密切相关。nmda受体存在多个亚基。其中nr1亚基对功能性glun通道的聚集有重要作用,广泛分布于中枢神经系统,为功能性的nmda受体所必需,是该受体的基本单位。虽然雄激素影响突触可塑性,突触可塑性的调节与突触标志性蛋白也密不可分,但是关于雄激素快速调节突触相关蛋白表达的报道尚不多见。我们之前的研究表明,雄激素(睾酮和双氢睾酮)能够通过非基因组效应上调老年去势samp8小鼠海马神经元突触蛋白snap25、syt1、syn、psd95、nr1和drebrin的蛋白表达,从而影响海马神经元的突触可塑性;双氢睾酮也可以上调mci期samp8去势小鼠海马神经元突触蛋白syn、psd95和drebrin的表达;本研究将进一步探讨睾酮能否引起原代海马神经元突触蛋白syn、psd95和nr1的蛋白和mrna表达水平快速变化。虽然诸多学者致力于睾酮对突触可塑性的快速作用研究,但是其作用机制至今仍未完全明了。突触可塑性受到多种信号通路调节,目前发现的雄激素作用相关的信号通路有erk/mapk、pka、pkc、p38/mapk、limk以及camkⅡ等。本实验重点研究细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,erk)及其下游的转录因子camp反应元件结合蛋白(campresponseelementbindingprotein,creb)在睾酮介导的神经元突触可塑性中发挥的作用。大量事实证明,兴奋性的谷氨酸能信号转导过程需要激活erk。在诸如学习和记忆等多种形式的神经系统高级活动中,该过程参与调控神经元的突触可塑性,包括功能可塑性(比如长时程增强ltp)和结构可塑性(比如树突棘的生长)。有关creb的研究起步很早,从无脊椎动物到啮齿类动物的研究都表明,creb依赖的转录对多种形式的学习和记忆都十分重要。creb的第133位丝氨酸磷酸化将引起其它经由camp反应元件(campresponseelement,cre)的转录机制来共同调控基因转录,因此推测creb第133位丝氨酸磷酸化是引起学习记忆相关基因表达至关重要的一步。我们之前对mci期samp8去势小鼠的研究发现,双氢睾酮会上调小鼠海马神经元erk和creb的磷酸化水平。据此我们推测erk/mapk和creb信号通路有可能参与介导雄激素对突触结构可塑性的调节。本实验将进一步探讨erk/mapk和creb信号通路是否在睾酮引起的原代海马神经元树突棘生长中发挥作用。综上所述,本课题以原代海马神经元为研究对象,考察雄激素通过上调树突棘密度影响突触结构可塑性的作用;揭示雄激素对于原代海马神经元突触标志性蛋白syn、psd95和nr1的蛋白和mrna表达水平的快速影响;并进一步研究雄激素快速调节突触结构可塑性的分子机制,探讨erk/mapk和creb信号通路是否参与其中。第一部分睾酮对原代海马神经元树突棘密度的快速调节作用目的:本课题采用体外培养的原代海马神经元为研究对象,旨在考察睾酮在短时间内对树突棘密度的快速调节作用。并利用睾酮-牛血清白蛋白(testosterone-bovineserumalbumin,t-bsa)不能穿透细胞膜的特点,进一步证明睾酮快速影响神经元结构可塑性的功能是通过膜受体介导的非经典途径实现的;考察经典的雄激素核受体抑制剂氟他胺(flutamide,flu)能否阻断雄激素膜受体介导的树突棘上调作用,以探讨雄激素膜受体和核受体之间有无特异性差别。方法:实验一原代海马神经元的培养和鉴定取17或18天的sd孕鼠,麻醉后取出胎鼠,断头取脑,剥离海马,组织破碎后于accutase中消化,玻璃吸管吹打,种植细胞悬液。海马神经元体外培养18天备用。以抗map2的免疫荧光细胞化学染色方法,对原代海马神经元进行纯度鉴定。map2对神经元的胞体和突起着色,hoechst33258对细胞核染色,根据公式map2阳性细胞数/hoechst33258阳性细胞数×100%,计算神经元的细胞纯度。实验二睾酮快速影响原代海马神经元树突棘密度的时效实验选用体外培养18天的原代海马神经元,随机分为对照组(0min组)、15min处理组(15min组)、30min处理组(30min组)、1h处理组(1h组)和2h处理组(2h组)。时效实验加入睾酮时间分别为15min,30min,1h和2h。根据参考文献,施加睾酮的浓度为10nm,对照组给予等量dmso处理。作用完毕后,对神经元进行大脑发育调节蛋白(developmentallyregulatedbrainprotein,drebrin)的免疫荧光细胞化学染色,观察睾酮作用不同时间树突棘密度的变化。600×光镜下计数原代海马神经元胞体50μm以外、每20μm树突上棘的数目,计算平均每μm树突上棘的数目作为树突棘密度。实验三睾酮快速影响原代海马神经元树突棘密度的量效实验实验选用体外培养18天的原代海马神经元,根据参考文献以及预实验结果,按照加入睾酮的浓度随机分为1nm组(1nm组)、10nm(10nm组)、100nm(100nm组)、1000nm(1000nm组)。睾酮作用时间选定为时效实验中雄激素对树突棘密度影响最为显著的1h。之后对神经元进行抗drebrin的免疫荧光细胞化学染色,观察神经元在不同剂量的睾酮作用下树突棘密度的变化。实验四睾酮快速影响原代海马神经元树突棘密度的实验实验选用体外培养18天的原代海马神经元,随机分为对照组(con组)、睾酮组(t组)、睾酮-牛血清白蛋白组(t-bsa组)、氟他胺+睾酮组(f+t组)。依据上述实验结果,确定雄激素对树突棘密度影响最为显著的时间和剂量分别为1h和10nm。氟他胺于睾酮加入前预先作用1h。抗drebrin的免疫荧光细胞化学染色标记神经元的树突棘,观察10nm的睾酮作用1h后树突棘密度的变化。结果:1原代海马神经元纯度鉴定用神经元特异性标记物map2抗体标记神经元,二抗采用dylight594标记为红光,hoechst33258复染标记全部细胞胞核。map2阳性细胞的胞浆、轴突和树突均呈红色,胞核不着色,hoechst33258标记胞核呈蓝色。神经元纯度为map2阳性细胞数占hoechst33258标记总细胞核数的比值,结果显示原代海马神经元细胞纯度>90%。2睾酮快速影响原代海马神经元树突棘密度的时效实验用抗drebrin的免疫荧光细胞化学染色来显示原代海马神经元的树突棘,可见在给予睾酮处理的2h内,各实验组树突棘的密度均有不同程度的增加。以给药1h组树突棘的密度2.08±0.15thorns/μm为最大,较对照组1.3±0.15thorns/μm明显增加,差异有统计学意义(p<0.01)。给药2h组,树突棘密度为1.75±0.15thorns/μm,与1h组相比减少,差异有统计学意义(p<0.01)。多重比较分析组间数据发现,各组间差异均有统计学意义(p<0.05)。3睾酮快速影响原代海马神经元树突棘密度的量效实验不同剂量的睾酮作用于原代海马神经元,树突棘密度分别为1nm组1.54±0.16thorns/μm、10nm组2.15±0.14thorns/μm、100nm组1.92±0.18thorns/μm、1000nm组1.39±0.18thorns/μm。以10nm组神经元的树突棘密度为最大,较其它三组均明显增高,差异有统计学意义(p<0.05);其次是100nm组,较1nm组和1000nm组均有明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。4睾酮快速影响原代海马神经元树突棘密度的实验与con组(1.12±0.10)相比,t组(1.96±0.19)、t-bsa组(1.90±0.18)和f+t组(1.34±0.14)的树突棘密度均明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);f+t组树突棘密度较t组和t-bsa组减低,差异亦有统计学意义(p<0.05);t组和t-bsa组相比,无明显差异(p>0.05)。结论:1给予不同剂量的睾酮,对原代海马神经元作用不同时间,都可以引起树突棘密度的增高。以10nm的睾酮处理1h引起树突棘密度增加的作用最为显著。2睾酮可以在短时间内上调树突棘密度,该作用主要通过非经典的膜受体介导而完成。3经典的雄激素核受体抑制剂氟他胺不能完全阻断睾酮对树突棘生长的快速调节作用,原代海马神经元胞膜上的雄激素结合位点与经典的核受体存在一定的差异。第二部分睾酮对原代海马神经元突触蛋白表达的快速影响目的:采用体外培养的原代海马神经元为研究对象,检测睾酮对海马神经元突触标志性蛋白syn、psd95和nr1蛋白表达和mrna表达的快速影响。探索雄激素的快速作用与突触标志性蛋白表达之间的关系,有助于理解雄激素发挥生理作用的方式。方法:实验一免疫荧光细胞化学实验检测突触标志性蛋白syn、psd95和nr1的蛋白表达实验选用体外培养18天的原代海马神经元,随机分为对照组(con组)、睾酮组(t组)、睾酮-牛血清白蛋白组(t-bsa组)和氟他胺+睾酮组(f+t)。根据第一部分实验结果确定t组、t-bsa组给药浓度分别为10nm、0.36nm,作用时间为1h;氟他胺预处理时间为1h。之后行抗syn、psd95和nr1的免疫荧光细胞化学染色。采集图像,计算平均荧光强度,分析在睾酮快速作用下,这些突触标志性蛋白表达的变化。实验二蛋白质免疫印迹实验检测突触标志性蛋白syn、psd95和nr1的蛋白表达实验对象、实验分组和给药方式同实验一。海马神经元经药物干预后提取细胞蛋白,进行蛋白质免疫印迹实验。odyssey红外成像系统显影成像,以gapdh的表达做为内参,测定各组突触蛋白的相对表达水平。实验三实时荧光定量pcr方法检测突触标志性蛋白syn、psd95和nr1的mrna表达实验对象、实验分组和给药方式同实验一。海马神经元经药物干预后提取细胞mrna,反转录合成第一链,之后实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr,q-pcr)方法检测各实验组突触标志性蛋白syn、psd95和nr1在睾酮作用下mrna表达水平的快速变化。结果:1免疫荧光细胞化学方法检测syn、psd95和nr1的蛋白表达syn的免疫荧光细胞化学实验结果显示:与con组(0.064±0.003)相比,t组(0.089±0.004)、t-bsa组(0.085±0.004)和f+t组(0.070±0.004)的平均荧光强度均明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);f+t组的荧光强度较t组和t-bsa组减低,差异亦有统计学意义(p<0.05);t组和t-bsa组相比,无明显差异(p>0.05)。psd95的免疫荧光细胞化学实验结果显示:与con组(0.047±0.004)相比,t组(0.074±0.004)、t-bsa组(0.070±0.004)和f+t组(0.070±0.005)的平均荧光强度明显增加,差异均有统计学意义(p<0.01);而t组、t-bsa组和f+t组之间,任两组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。nr1的免疫荧光细胞化学实验结果显示:与con组(0.031±0.004)相比,t组(0.074±0.004)、t-bsa组(0.074±0.003)和f+t组(0.044±0.003)的平均荧光强度明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);f+t组的荧光强度较t组和t-bsa组减低,差异亦有统计学意义(p<0.05);t组和t-bsa组相比,无明显差异(p>0.05)。2蛋白质免疫印迹法检测syn,psd95和nr1的蛋白表达syn的免疫印迹实验结果显示:与con组(1.478±0.074)相比,t组(2.787±0.153)、t-bsa组(2.629±0.155)和f+t组(2.164±0.144)条带相对于内参gapdh的光密度值明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);f+t组的光密度值较t组和t-bsa组减低,差异亦有统计学意义(p<0.05);t组和t-bsa组相比,无明显差异(p>0.05)。psd95的免疫印迹实验结果显示:与con组(0.276±0.017)相比,t组(0.460±0.035)、t-bsa组(0.463±0.015)和f+t组(0.427±0.025)条带相对于内参gapdh的光密度值明显增加,差异均有统计学意义(p<0.01);而t组、t-bsa组和f+t组之间,任两组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。nr1的免疫印迹实验结果显示:与con组(0.031±0.004)相比,t组(0.069±0.003)、t-bsa组(0.070±0.004)和f+t组(0.037±0.003)条带相对于内参gapdh的光密度值明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);f+t组的光密度值较t组和t-bsa组减低,差异亦有统计学意义(p<0.05);t组和t-bsa组相比,无明显差异(p>0.05)。3q-pcr技术检测syn,psd95和nr1的mrna表达syn的q-pcr实验结果显示:与con组相比,t组(28.22±3.57)、t-bsa组(32.57±3.62)和f+t组(11.63±0.29)的mrna表达水平均明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);f+t组的mrna表达较t组和t-bsa组减低,差异亦有统计学意义(p<0.05);t组和t-bsa组相比,无明显差异(p>0.05)。psd95的q-pcr实验结果显示:与con组相比,t组(5.94±0.22)、t-bsa组(5.85±0.21)和f+t组(5.40±0.08)的mrna表达水平明显增加,差异均有统计学意义(p<0.01);而t组、t-bsa组和f+t组之间,任两组比较差异无统计学意义(p>0.05)。nr1的q-pcr实验结果显示:与con组相比,t组(20.64±0.45)、t-bsa组(20.04±0.62)和f+t组(3.21±0.10)的mrna表达水平明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);f+t组的mrna表达较t组和t-bsa组减低,差异亦有统计学意义(p<0.05);t组和t-bsa组相比,无明显差异(p>0.05)。结论:1睾酮及睾酮-牛血清白蛋白能快速上调原代海马神经元突触标志性蛋白syn、psd95和nr1的蛋白和mrna表达。2氟他胺预处理部分阻断了睾酮引起的突触蛋白syn和nr1的蛋白及mrna表达增加,未能抑制睾酮引起的psd95的蛋白和mrna表达上调。3睾酮对原代海马神经元突触标志物syn、psd95和nr1蛋白和mrna表达的上调作用主要通过非基因组途径实现。第三部分erk/mapk和creb信号通路参与睾酮对原代海马神经元突触结构可塑性的调节作用目的:以原代海马神经元为研究对象,观察睾酮对神经元erk/mapk和creb磷酸化水平的快速影响;为证明该信号通路的特异性,对原代海马神经元给予u0126预处理,观察其是否特异性的阻断由睾酮引起的erk/mapk和creb磷酸化,以及由睾酮引起的神经元树突棘密度增加。本课题旨在进一步探讨睾酮影响原代海马神经元突触结构可塑性的分子机制。方法:实验一睾酮对原代海马神经元erk/mapk和creb磷酸化水平的影响实验选用体外培养18天的原代海马神经元,随机分为对照组(con组)、睾酮组(t组)、睾酮-牛血清白蛋白组(t-bsa组)和氟他胺+睾酮组(f+t)。t、t-bsa和f的给药方法和剂量与第二部分相同。提取神经元的蛋白,bca方法进行蛋白定量,以液相蛋白芯片技术检测erk1/2/mapk和creb的磷酸化水平。实验二u0126预处理后睾酮对erk/mapk和creb磷酸化的影响实验分组同实验一。t、t-bsa和f的给药方法同第一、二部分。体外培养18天的原代海马神经元,给予睾酮之前,先用u0126处理1h,之后采用蛋白质免疫印迹方法检测erk1/2/mapk和creb的磷酸化水平。实验三u0126预处理后睾酮对树突棘密度的影响实验分组和给药方法同实验二。抗drebrin免疫荧光细胞化学染色方法观察原代海马神经元树突棘密度,探讨u0126在睾酮上调树突棘密度过程中的抑制作用。结果:1睾酮对原代海马神经元erk/mapk和creb的快速活化作用erk1/2/mapk的液相蛋白芯片实验结果显示:与con组(0.069±0.007)相比,t组(0.357±0.026)、t-bsa组(0.364±0.050)和f+t组(0.178±0.031)的磷酸化水平均明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);f+t组的磷酸化水平较t组和t-bsa组减低,差异亦有统计学意义(p<0.05);t组和t-bsa组相比无明显差异(p>0.05)。creb的液相蛋白芯片实验结果显示:与con组(0.243±0.045)相比,t组(0.862±0.121)、t-bsa组(0.890±0.086)和f+t组(0.551±0.017)的磷酸化水平均明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);f+t组的磷酸化水平较t组和t-bsa组减低,差异亦有统计学意义(p<0.05);t组和t-bsa组相比,无明显差异(p>0.05)。液相蛋白芯片技术检测到各实验组中,erk/mapk和creb的总蛋白水平无变化(p>0.05)。2u0126抑制了睾酮引起的erk1/2/mapk和creb活化原代海马神经元经u0126处理1h后,给予睾酮和睾酮-牛血清白蛋白作用,采用蛋白质免疫印迹法检测erk1/mapk和erk2/mapk的磷酸化水平。结果如下,con组:0.345±0.054、0.034±0.002;t组:0.288±0.029、0.035±0.002;t-bsa组:0.350±0.014、0.036±0.003;f+t组:0.403±0.038、0.032±0.002。erk1和erk2的磷酸化水平在各组之间比较差异均无统计学意义(p>0.05)。免疫印迹实验检测creb的磷酸化水平。结果显示:con组,0.168±0.007;t组,0.161±0.007;t-bsa组,0.178±0.001;f+t组,0.164±0.007。各组间磷酸化水平无明显变化,差异无统计学意义(p>0.05)。3u0126抑制了由睾酮引起的神经元树突棘密度的快速增加原代海马神经元经u0126处理1h后,继而给予睾酮和睾酮-牛血清白蛋白作用,抗Drebrin的免疫荧光细胞化学实验检测到神经元树突棘密度的结果显示,Con组为1.01±0.18、T组为0.98±0.19、T-BSA组为1.03±0.21、F+T组为1.02±0.14。数据进行统计学分析,发现各组间无差异(P>0.05)。结论:1睾酮和睾酮-牛血清白蛋白均可引起ERK/MAPK和CREB的快速磷酸化。2 U0126可以抑制由睾酮和睾酮-牛血清白蛋白引起的ERK/MAPK和CREB磷酸化。3 U0126可以抑制由睾酮和睾酮-牛血清白蛋白引起的神经元树突棘密度快速增加。4 ERK/MAPK和CREB信号通路参与睾酮对突触结构可塑性的快速调节作用。