背景:强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是严重危害人类健康,最终导致残疾或完全丧失劳动力的慢性全身性自身免疫性疾病。AS在我国的发病率为0.2％-0.6%,患者400万左右,男女比例为5-10:1,好发于青壮年。AS的病因不清,病机不详,但是HLA-B27与AS的相关性最大。AS是HLA-B27分子诱发的多种因素所导致成骨组织发生的自身免疫性反应。目前所用药物与方案主要为非特异性的传统药物或和生物类药物,在具有一定疗效的同时,其毒副作用严重。因此,深入探究AS的发病机制、研发特异性治疗药物就显得尤为重要和迫切。　　研究资料表明,HLA-B27与AS的发生最为相关,是其免疫病理反应发生的关键分子;而且,HLA-B*2705为B27等位基因的祖先基因,其他等位基因都是从它的基础上进化而来。HLA-B*2705等位基因频率在中国汉族B27阳性AS患者中为41.1%,是AS发病的关键分子之一。此外,HLA-B27分子的α1α2结构域是其与抗原肽结合的关键位置,因此,我们选择HLA-B*2705α1α2结构域作为靶标来筛选能特异性阻断HLA-B*2705免疫致病机理的拮抗肽(antagonist peptide,AP)。鉴于此,本研究建立了基于HLA-B*2705α1α2结构域拮抗肽的强直性脊柱炎治疗性疫苗及其转基因动物模型,为HLA-B27拮抗肽治疗性基因疫苗在强直性脊柱炎模型中的疗效观察和治疗机理研究提供实验基础和动物模型支持。　　目的:1.建立基于HLA-B*2705α1α2结构域拮抗肽的新型治疗性DNA疫苗,并体外观察其特异性封闭B27分子以阻断其与特异性抗体结合的功能。　　2.建立HLA-B*2705强制性脊柱炎转基因小鼠模型,为阐述基于拮抗肽的新型治疗性DNA疫苗逆转AS病理性免疫状态的作用机制,探索其治疗强直性脊柱炎的可行性,提供源源不断的样本保障。　　方法:1、设计合适引物,提取HLA-B*2705α1α2结构域编码基因,并构建含HLA-B*2705α1α2结构域编码基因的PET-32a原核表达载体,将载体转化进入 TOP10感受态细胞中,经IPTG诱导表达和His-Tag融合蛋白层析纯化后,收集蛋白,采用补体依赖性淋巴毒实验,对α1α2结构域蛋白的活性进行鉴定。　　2、收集纯化后的α1α2结构域蛋白,采用噬菌体展示肽库(Phage display peptide library)技术进行拮抗肽的筛选,经过3轮淘洗,富集阳性噬菌体,在涂有IPTG和X-Gal平板上挑取20个蓝色菌斑扩增培养并进行ELISE检测,同时提取噬菌体DNA,进行测序;选取OD值大,而且通过测序重复序列多的作为所需要的序列;根据拮抗肽序列设计4条长引物,构建含拮抗肽序列的pcDNA3.1-AP和pcDNA3.1-EGFP-AP真核表达载体,采用GenFectin介导方法转染到COS7细胞中进行蛋白表达,荧光显微镜下观察含pcDNA3.1-EGFP-AP的COS7细胞,以确定拮抗肽能否表达;根据拮抗肽序列,由体外合成所需要的拮抗肽,将表达肽段与合成肽段同时进行B27抗体与B27阳性细胞结合的阻断实验,通过流式观察结果,来确定拮抗肽的阻断效果。　　3、从美国Taconic Transgenic Exchange TM公司购入mβ2m-/-基因缺陷性C57小鼠;提取HLA-B*2705全长基因和hβ2m基因,交由华大基因公司进行转基因C57小鼠模型的制备;将制备成功的HLA-B*2705+hβ2m+转基因小鼠模型和mβ2m-/-的小鼠模型通过杂交、回交等方式进行交配,提取小鼠的DNA和RNA进行检测,最终筛选出纯合HLA-B*2705+hβ2m+mβ2m-/-小鼠模型。　　结果:1、成功构建含HLA-B*2705α1α2结构域编码基因的PET-32a原核表达载体;经转化进入TOP10感受态细胞中,α1α2结构域成功地以可溶性形式表达;经层析纯化后,得到纯化后的蛋白分子。经补体依赖性淋巴毒实验,最终获得具有生物活性的α1α2结构域分子。　　2、利用噬菌体展示肽库技术,经过3轮淘洗成功筛选出与HLA-B*2705分子高度亲和的拮抗肽,序列为X1(OD值:1.5,因具有商业价值故序列保密)。成功构建含拮抗肽序列X1的pcDNA3.1-X1和pcDNA3.1-EGFP-X1真核表达载体。pcDNA3.1-EGFP-X1真核表达载体经转染COS7细胞,可观察到绿色荧光蛋白表明拮抗肽可高效表达。体外拮抗肽阻断实验结果表明,拮抗肽可以成功阻断B27抗体与B27阳性细胞的结合,并与体外合成的肽段相比,细胞合成的拮抗肽的阻断效果更好。　　3、成功提取HLA-B*2705和hβ2m基因,并成功建立含HLA-B*2705+hβ2m+转基因C57小鼠。通过与mβ2m-转基因C57小鼠交配,在F1代得到HLA-B*2705+hβ2m+mβ2m+/-小鼠模型。对F2代采用杂交和回交的方式进行交配,成功筛选出纯合HLA-B*2705+hβ2m+mβ2m-/-小鼠模型。　　结论:通过以上研究,本研究首先成功表达出HLA-B*2705α1α2结构域的可溶性蛋白分子,为进一步通过噬菌体筛选技术筛选拮抗肽提供了可溶性蛋白保障。其次,本研究成功构建了基于HLA-B*2705α1α2结构域拮抗肽的强直性脊柱炎治疗性疫苗。本研究成功筛选出HLA-B*2705特异性拮抗肽,并构建了pcDNA3.1-B*2705-AP以及pcDNA3.1-B*2705-EGFP-AP真核表达载体,证明拮抗肽可在COS7细胞中表达。体外实验证实拮抗肽能够阻断HLA-B27单抗与HLA-B27阳性细胞的结合,并同时证实细胞表达拮抗肽比体外合成拮抗肽的阻断效果更好。最后,本研究初步建立了HLA-B*2705+hβ2m+mβ2m-/-小鼠模型,为进一步动物实验提供样本保障。综上所述,本研究为今后基于HLA-B27拮抗肽的治疗性基因疫苗在AS动物模型中的疗效观察以及治疗机理的研究提供了实验基础和动物模型。