研究背景在全球范围内,乳腺癌是女性群体中发病率最高的恶性肿瘤,且其发病率逐年攀升,对患者的生命健康造成了极大威胁。其中,三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是侵袭性最强的乳腺癌亚型之一,患者容易出现早期复发转移,且预后较差。目前化疗在TNBC的系统性治疗中仍占据主导地位,然而大部分患者会在治疗过程中面临化疗耐药的问题,这严重限制了化疗的治疗效果,最终导致患者的复发转移甚至死亡。因此深入探究TNBC进展转移的分子机制,寻找TNBC治疗的新靶点是目前临床工作中亟需突破的重点和难点。近年来,环状RNA（circular RNA,circRNA）在人类癌症发生发展中的作用及潜在机制逐渐受到了研究者们的重视。与传统的线性RNA不同,circRNA不具有5’端帽子和3’端多聚A尾,其5’端和3’端通过共价键结合呈闭环结构。起初circRNA被认为是细胞内可变剪接产生的垃圾产物,但随着近几年RNA高通量测序技术的发展,越来越多具有生物学功能的circRNA被发掘出来。CircRNA的异常表达及其对肿瘤生物学行为的调控作用已在多种人类癌症中被报道。本研究发现hsacirc0004623在乳腺癌组织,尤其是TNBC组织中表达显著上调,且与患者的不良预后显著相关。Hsacirc0004623是由其宿主基因HIF1A的2-6外显子反向剪切环化而成,因此我们将其命名为circHIF1A。经文献检索,circHIF1A的生物学功能在我们之前没有相关报道,为了研究circHIF1A的表达紊乱在TNBC进展中的作用,我们进行了一系列体内外实验和分子生物学实验,从不同层次对circHIF1A的生物学功能和潜在机制进行了探究。研究方法与结果本研究分为三个部分,各部分研究方法和研究结果如下:第一部分circHIF1A在乳腺癌中的表达及其临床意义研究方法1.通过反转录-实时定量 PCR（reverse transcription-real-time quantitative PCR,RT-qPCR）和原位杂交（in-situ hybridization,ISH）实验检测circHIF1A在乳腺癌组织和周围正常乳腺组织中的表达情况,比较整体乳腺癌组织和正常乳腺组织、TNBC组织和非三阴性乳腺癌（non-TNBC）组织中circHIF1A的表达水平。2.利用t检验、Log-rank检验、Cox比例风险回归模型构建等统计学方法分析circHIF1A表达与淋巴结转移状态、激素受体状态等临床病理学特征间的关系以及对患者预后的影响。3.通过Sanger测序、RNase R处理、放线菌素D处理等在TNBC细胞中对circHIF1A的环状结构进行验证。研究结果1.circHIF1A在乳腺癌组织中的表达显著高于周围正常乳腺组织,在TNBC组织中的表达显著高于non-TNBC组织中的表达。2.circHIF1A的表达与淋巴结转移状态呈正相关,与ER、PR及HER-2表达呈负相关。circHIF1A是乳腺癌患者预后的独立预测因子,其高表达与预后不良相关。3.circHIF1A确实是存在于TNBC细胞中且具有高度稳定性的环状RNA。第二部分circHIF1A促进TNBC进展转移的功能研究研究方法1.通过 RNA 高通量测序分析（RNA high throughput sequencing analysis,RNA-seq）筛选在circHIF1A过表达TNBC细胞和对照细胞中差异表达的基因,并对差异基因进行基因本体（gene ontology,GO）分析,初步确定circHIF1A可能调控的生物学功能。2.通过MTT、克隆形成和EdU等体外实验检测过表达或敲低circHIF1A对TNBC增殖能力的影响;利用Transwell、划痕实验等体外实验验证circHIF1A对TNBC迁移能力的影响;利用流式细胞术检测circHIF1A对TNBC凋亡水平的影响。3.分别构建乳腺癌皮下肿瘤异种移植模型和乳腺癌肺转移小鼠模型,在体内研究circHIF1A对TNBC生长转移能力的影响。研究结果1.GO分析显示circHIF1A可能对TNBC细胞的生长、细胞黏附、免疫应答等生物学过程具有调控作用。2.体外实验结果表明,circHIF1A过表达可显著促进TNBC细胞的增殖、DNA合成和迁移能力,显著抑制细胞的凋亡水平;而干扰circHIF1A可抑制TNBC的增殖转移和DNA合成,并促进细胞的凋亡。3.体内动物实验表明,circHIF1A稳定过表达的TNBC细胞具有更强的成瘤能力和肺转移能力,而敲低circHIF1A则具有相反的效果。第三部分circHIF1A促进TNBC进展转移的分子机制研究研究方法1.通过细胞RNA核质分离实验和荧光原位杂交实验（fluorescence in-situ hybridization,FISH）明确circHIF1A在TNBC细胞内的定位。2.利用生物信息学网络工具分析可能与circHIF1A相互作用的下游靶基因,并通过RNA pull-down、RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）和双荧光素酶报告实验等技术对circHIF1A与靶基因间的相互作用进行验证。3.利用RT-qPCR、Western blotting、免疫荧光和蛋白核质分离等技术检测circHIF1A对下游靶基因表达和亚细胞定位的影响。4.利用MTT、EdU和Transwell进行挽救实验,探究circHIF1A对下游靶基因的调控在circHIF1A功能中的介导作用。5.利用生物信息学分析、RNA pull-down、RIP和染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）等实验技术对circHIF1A的环化机制进行探究,探索circHIF1A在TNBC中显著上调的原因。研究结果1.circHIF1A主要定位于细胞质,根据关于circRNA作用机制的文献报道,我们推测circHIF1A可能通过与微小RNA（microRNA,miRNA）或胞质蛋白相互作用发挥促癌功能。2.circHIF1A可以与AGO2相互结合,这提示circHIF1A具有作为miRNA“吸附海绵”的潜能,进一步研究发现circHIF1A可以与miR-149-5p相互作用。3.利用 miRwalk、Pictar、TargetScan 和 RNA22 数据库预测 miR-149-5p 的靶标 mRNA,确定NFIB是miR-149-5p的下游靶点,miR-149-5p与NFIB 3’UTR区的结合得到了双荧光素酶报告实验的验证。4.miR-149-5p可以下调NFIB mRNA及蛋白的表达,而circHIF1A可以促进NFIB的表达。此外,circHIF1A可以通过与NFIB蛋白结合促进后者的核转运。5.circHIF1A对miR-149-5p/NFIB的调控介导了其在TNBC进展转移中的促进作用。6.RNA结合蛋白FUS可以与circHIF1A前体RNA（pre-HIF1A）的1号内含子区结合,并促进circHIF1A的环化。7.FUS在TNBC组织中呈高表达,且与TNBC患者的预后不良显著相关;过表达FUS可以显著促进TNBC细胞的增殖和迁移能力,干扰FUS则明显抑制TNBC的进展。8.NFIB可以与FUS基因的启动子区结合,并促进FUS的转录激活和circHIF1A的表达,从而形成了 FUS/circHIF 1A/NFIB这一促进TNBC进展转移的正反馈调控通路。研究结论1.circHIF1A在TNBC组织中显著高表达,其表达紊乱在TNBC的进展转移中发挥重要的作用。2.circHIF1A既可以通过对miR-149-5p的“海绵吸附”作用促进癌基因NFIB的表达,又可以与NFIB蛋白结合从而促进其核转运过程。3.circHIF1A的环化过程受RNA结合蛋白FUS的正向调控,而NFIB又可以作为转录因子促进FUS的转录激活,从而形成了 FUS/circHIF1A/NFIB这一促进TNBC进展的正反馈调节通路。FUS/circHIF1A/NFIB信号轴有望成为TNBC治疗的新靶点。4.circHIF1A在乳腺癌患者的肿瘤组织中表达上调,并与患者的预后不良显著相关,有望成为乳腺癌诊断和预后预测的新型生物标志物。