论文部分内容阅读
[目的]
环黄芪醇（Cycloastragenol,CAG）能激活端粒酶，具有多种药理学作用。课题组前期实验发现环黄芪醇能促进体外MC3T3-E1细胞和C2C12细胞增殖、分化与矿化，提示环黄芪醇有促骨形成作用；环黄芪醇能预防D-半乳糖（D-Galatose,D-Gal）致大鼠骨丢失现象，初步证实其对药物导致衰老的动物模型的预防作用。为了进一步验证环黄芪醇对衰老所致骨丢失的预防作用，本实验采用自然衰老动物模型观察药物的作用，进一步明确环黄芪醇的抗衰老作用对骨代谢的影响及其机制，为开发环黄芪醇抗骨质疏松的新用途提供实验数据，也为从抗衰老药物中寻找防治骨质疏松的药物提供研究思路。
[方法]
采用48只SPF级SD雌性大鼠，3月龄8只，平均体重（239.5±12）g，饲养到7月龄作为年龄对照组。12月龄大鼠40只随机分成4组，每组10只，分为自然衰老骨质疏松模型组（0.5%CMC-Na5ml.kg-1d-1）、CAG（L）剂量组（CAG3.5mg.kg-1d-1）、CAG（M）剂量组（CAG7mg.kg-1d-1）、CAG（H）剂量组（CAG14mg.kg-1d-1），为复制自然衰老模型骨质疏松大鼠饲养33周，期间每天灌胃给予相应浓度CAG，实验结束时大鼠为21月龄。大鼠每周称重一次并及时调整给药剂量，实验结束前13、14天和3、4天，皮下注射钙黄绿素进行荧光标记。实验结束时，大鼠心脏采血后处死，取血清进行相关生化指标的检测，分离股骨、子宫、卵巢，记录湿重并进行子宫的病理切片，分离双侧股骨、胫骨进行骨组织形态计量学、骨生物力学、Micro-CT、蛋白组学等检测。
[结果]
1.体重数据显示，与年龄对照组对比，模型组大鼠体重增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组对比，环黄芪醇低剂量组体重增加（P<0.05），实验中、后期环黄芪醇中、高剂量组体重有增加的趋势。
2.血清分子标志物浓度数据显示，与年龄对照组相比，模型组血清PINP水平有下降趋势，血清CTXⅠ有上升趋势（P=0.058），血清雌二醇（E2）浓度下降（P<0.05）。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组血清PINP、CTXⅠ和E2无明显变化；环黄芪醇中剂量组血清PINP和CTXⅠ无明显变化，E2浓度增加（P<0.05）；环黄芪醇高剂量组PINP、CTXⅠ和E2无显著变化。结果提示血清中雌激素水平下降，而环黄芪醇能升高血清雌激素浓度。
3.分析大鼠子宫重量、子宫重量指数、子宫内、浆膜厚度变化，结果显示模型组大鼠子宫重量、子宫重量指数下降，子宫内膜和浆膜有下降的趋势。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组子宫重量、子宫重量指数、子宫内膜和浆膜没有显著变化；环黄芪醇中剂量组子宫重量、子宫重量和子宫内膜厚度有增加的趋势，子宫浆膜厚度增加（P<0.05）。环黄芪醇高剂量组子宫内膜厚度有上升趋势，子宫重量和子宫重量指数无显著变化，子宫浆膜厚度增加（P<0.05）。结果提示自然衰老大鼠子宫衰退，而环黄芪醇能增加子宫浆膜厚度，改善子宫衰退。
4.股骨重量数据显示，与年龄对照组对比，模型组体重显著增加（P<0.05），股骨湿重增加，但差异无统计学意义（P>0.05），股骨重量指数减少12.3%（P<0.05）。与模型组相比，环黄芪醇低、中、高剂量组股骨湿重、股骨重量指数无明显变化。股骨重量数据提示，与年龄对照组相比，模型组股骨承受的压力增大。
5.骨生物力学数据显示，与年龄对照组相比，模型组刚性系数增加24.3%，但差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组弹性桡度增加21%，但差异无统计学意义（P>0.05），弹性载荷、最大载荷、断裂载荷增大（P<0.05）；环黄芪醇高剂量组刚性系数增加11.9%，但差异无统计学意义（P>0.05）。骨生物力学数据提示低剂量环黄芪醇对骨生物力学性能有改善作用。
6.胫骨上段松质骨二维形态计量学结果显示，与年龄对照组相比，模型组骨小梁面积百分数（%Tb.Ar）减少、骨小梁数量（Tb.N）减少、骨小梁分离度（Tb.Sp）增高（P<0.05），骨小梁厚度（Tb.Th）、荧光周长百分率（%L.Pm）、钙盐沉积率（MAR）、骨表面新骨形成率（BFR/BS）和骨转换率（BRF/BV）有下降趋势，新骨年形成率（BFR/TV）下降62.8%（P<0.05），成骨细胞周长百分数（%Ob.S.Pm）减少45.7%（P>0.05），破骨细胞周长百分数（%Oc.S.Pm）、破骨细胞数量（Oc.N）无明显变化。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组破骨细胞周长百分数及破骨细胞数量降低（P<0.05）；环黄芪醇中剂量组骨小梁面积百分数增加20.5%、骨小梁厚度增加3.4%、骨小梁数量增加14.3%，骨小梁分离度有下降13%，荧光周长百分率下降37.6%、钙盐沉积率下降8.9%、骨表面新骨形成率下降43.9%、骨转换率下降45.7%、新骨年形成率下降25.1%、成骨细胞周长百分数增加44.6%，但差异无统计学意义（P>0.05），破骨细胞数量、破骨细胞周长百分数有下降趋势。胫骨上段松质骨二维形态计量学结果提示，模型组骨量减少，骨代谢活动下降，具有低转换型骨质疏松的特征；环黄芪醇低剂量组有抑制骨吸收的作用；环黄芪醇中剂量组有促进骨形成、抑制骨吸收、增加骨量的趋势。
7.胫骨中段皮质骨二维形态计量学结果显示，与年龄对照组相比，模型组皮质骨面积（Ct.Ar）上升18.1%（P<0.05），骨外膜荧光标记百分数（%P-L.Pm）下降44.9%，骨内膜荧光标记百分数（%E-L.Pm）下降23.4%，但差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组骨外膜荧光标记百分数上升114.4%（P<0.05），骨内膜荧光标记百分数上升27.4%，但差异无统计学意义（P>0.05）；环黄芪醇中剂量组骨外膜荧光标记百分数上升88.1%，骨内膜荧光标记百分数上升30.1%，但差异无统计学意义（P>0.05）；环黄芪醇高剂量组骨外膜荧光标记百分数上升123.1%（P<0.05），骨内膜荧光标记百分数上升51%，但差异无统计学意义（P>0.05）。胫骨中段皮质骨二维形态计量学结果提示环黄芪醇低、高剂量组具有促进骨形成和矿化的作用。
8.三维图像计量学结果显示，与年龄对照组相比，模型组连接密度（Conn-Dens）降低（P<0.05），结构模型指数（SMI）上升（P<0.05），骨密度（BMD）下降（P<0.05），骨体积分数（BV/TV）下降65.1%（P<0.05），骨小梁数量（Tb.N）下降53.8%（P<0.05），骨小梁厚度（Tb.Th）下降26.4%（P<0.05），骨小梁分离度上升221.5%（P<0.05）。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组连接密度、骨密度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度有上升趋势，骨小梁分离度、结构模型指数有下降趋势，但差异均无统计学意义（P>0.05）；环黄芪醇中剂量组骨小梁厚度增加18.9%（P<0.05），结构模型指数下降33%（P<0.05），连接密度上升51.4%，骨密度增加25%，骨体积分数升高71.2%，骨小梁数量增加40.9%，骨小梁分离度下降29.9%，但差异无统计学意义（P>0.05）。三维图像计量学结果提示环黄芪醇中剂量组可增加自然衰老大鼠的骨小梁厚度，改善骨小梁结构。
9.蛋白组学鉴定出4332种蛋白质，与年龄对照组相比，模型组共803差异表达蛋白质，其中373蛋白表达上调，430蛋白质表达下调。与模型组相比，环黄芪醇中剂量组共80差异表达蛋白质，其中26蛋白质上调，54蛋白下调。差异表达蛋白GeneOntology（GO）功能富集分析及通路富集分析发现，与年龄对照组相比，模型组增殖、分化及免疫调节相关功能、通路发生显著变化（P<0.05），免疫相关蛋白质下调多于上调，提示免疫衰老，骨激活素（Osteosctivin，OA），又名非转移性黑色素瘤糖蛋白B（Glycoproteintransmembranenonmetastaticmelanomaproteinb，GPNMB）有表达下调的趋势；与模型组相比，环黄芪醇中剂量组抗原提呈相关功能蛋白表达上调，主要组织相容性复合体Ⅱ（RT1-Bb、RT1-Da、RT1-Db1）表达上调（P<0.05），KEGG通路富集分析结果显示金黄色葡萄菌感染、系统性红斑狼疮症、类风湿性关节炎等免疫相关通路发生显著变化（P<0.05），免疫相关蛋白质上调多于下调，GPNMB表达上调（P<0.05）；雌激素信号通路蛋白--Kras表达上调（P<0.05）。以上结果提示环黄芪醇可能通过上调GPNMB表达及增强免疫细胞抗原提呈能力，延缓免疫衰老，同时通过E2/Kras信号通路起拟雌激素作用。
10.蛋白免疫印迹法结果显示，与年龄对照组相比，模型组GPNMB表达有下降趋势，MEK1/2表达无明显变化。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组GPNMB、MEK1/2表达无明显变化；环黄芪醇中剂量组GPNMB表达增加（P<0.01），MEK1/2表达增加（P<0.05）。环黄芪醇高剂量组GPNMB表达无明显变化，MEK1/2表达增加（P<0.05）。结果提示环黄芪醇能促进MEK1/2表达、GPNMB分泌，这种作用可能与环黄芪醇激活端粒酶、延缓免疫衰老有关。
[结论]
1.在SPF级环境饲养雌性SD大鼠至21月龄能成功复制自然衰老骨丢失模型，与年龄对照组相比，主要表现为体重增长缓慢，股骨重量指数、骨密度下降，骨小梁骨量减少，厚度减少，分离度上升，骨小梁网状结构破坏，骨形成和骨吸收活性下降，属于低转换型骨质疏松。
2.环黄芪醇具有预防自然衰老雌性大鼠骨组织衰退作用，其中低剂量环黄芪醇能抑制骨吸收，促进皮质骨内外膜骨矿化，增强骨生物力学性能。中剂量环黄芪醇能增加骨小梁厚度，保持骨小梁网状结构，抑制自然衰老引起的骨小梁骨质量下降。
3.环黄芪醇能上升血清E2浓度，增加子宫浆膜厚度，有一定对抗自然衰老性子宫衰退的作用。
4.环黄芪醇抗自然衰老骨质疏松的机制可能与激活端粒酶，促进骨髓微巨噬细胞分泌GPNMB，抗免疫细胞衰老，从而抑制破骨细胞、增强成骨细胞和间充质干细胞活性有关。也可能与其激动E2/Kras信号通路所引起的拟雌激素作用有关。
环黄芪醇（Cycloastragenol,CAG）能激活端粒酶，具有多种药理学作用。课题组前期实验发现环黄芪醇能促进体外MC3T3-E1细胞和C2C12细胞增殖、分化与矿化，提示环黄芪醇有促骨形成作用；环黄芪醇能预防D-半乳糖（D-Galatose,D-Gal）致大鼠骨丢失现象，初步证实其对药物导致衰老的动物模型的预防作用。为了进一步验证环黄芪醇对衰老所致骨丢失的预防作用，本实验采用自然衰老动物模型观察药物的作用，进一步明确环黄芪醇的抗衰老作用对骨代谢的影响及其机制，为开发环黄芪醇抗骨质疏松的新用途提供实验数据，也为从抗衰老药物中寻找防治骨质疏松的药物提供研究思路。
[方法]
采用48只SPF级SD雌性大鼠，3月龄8只，平均体重（239.5±12）g，饲养到7月龄作为年龄对照组。12月龄大鼠40只随机分成4组，每组10只，分为自然衰老骨质疏松模型组（0.5%CMC-Na5ml.kg-1d-1）、CAG（L）剂量组（CAG3.5mg.kg-1d-1）、CAG（M）剂量组（CAG7mg.kg-1d-1）、CAG（H）剂量组（CAG14mg.kg-1d-1），为复制自然衰老模型骨质疏松大鼠饲养33周，期间每天灌胃给予相应浓度CAG，实验结束时大鼠为21月龄。大鼠每周称重一次并及时调整给药剂量，实验结束前13、14天和3、4天，皮下注射钙黄绿素进行荧光标记。实验结束时，大鼠心脏采血后处死，取血清进行相关生化指标的检测，分离股骨、子宫、卵巢，记录湿重并进行子宫的病理切片，分离双侧股骨、胫骨进行骨组织形态计量学、骨生物力学、Micro-CT、蛋白组学等检测。
[结果]
1.体重数据显示，与年龄对照组对比，模型组大鼠体重增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组对比，环黄芪醇低剂量组体重增加（P<0.05），实验中、后期环黄芪醇中、高剂量组体重有增加的趋势。
2.血清分子标志物浓度数据显示，与年龄对照组相比，模型组血清PINP水平有下降趋势，血清CTXⅠ有上升趋势（P=0.058），血清雌二醇（E2）浓度下降（P<0.05）。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组血清PINP、CTXⅠ和E2无明显变化；环黄芪醇中剂量组血清PINP和CTXⅠ无明显变化，E2浓度增加（P<0.05）；环黄芪醇高剂量组PINP、CTXⅠ和E2无显著变化。结果提示血清中雌激素水平下降，而环黄芪醇能升高血清雌激素浓度。
3.分析大鼠子宫重量、子宫重量指数、子宫内、浆膜厚度变化，结果显示模型组大鼠子宫重量、子宫重量指数下降，子宫内膜和浆膜有下降的趋势。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组子宫重量、子宫重量指数、子宫内膜和浆膜没有显著变化；环黄芪醇中剂量组子宫重量、子宫重量和子宫内膜厚度有增加的趋势，子宫浆膜厚度增加（P<0.05）。环黄芪醇高剂量组子宫内膜厚度有上升趋势，子宫重量和子宫重量指数无显著变化，子宫浆膜厚度增加（P<0.05）。结果提示自然衰老大鼠子宫衰退，而环黄芪醇能增加子宫浆膜厚度，改善子宫衰退。
4.股骨重量数据显示，与年龄对照组对比，模型组体重显著增加（P<0.05），股骨湿重增加，但差异无统计学意义（P>0.05），股骨重量指数减少12.3%（P<0.05）。与模型组相比，环黄芪醇低、中、高剂量组股骨湿重、股骨重量指数无明显变化。股骨重量数据提示，与年龄对照组相比，模型组股骨承受的压力增大。
5.骨生物力学数据显示，与年龄对照组相比，模型组刚性系数增加24.3%，但差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组弹性桡度增加21%，但差异无统计学意义（P>0.05），弹性载荷、最大载荷、断裂载荷增大（P<0.05）；环黄芪醇高剂量组刚性系数增加11.9%，但差异无统计学意义（P>0.05）。骨生物力学数据提示低剂量环黄芪醇对骨生物力学性能有改善作用。
6.胫骨上段松质骨二维形态计量学结果显示，与年龄对照组相比，模型组骨小梁面积百分数（%Tb.Ar）减少、骨小梁数量（Tb.N）减少、骨小梁分离度（Tb.Sp）增高（P<0.05），骨小梁厚度（Tb.Th）、荧光周长百分率（%L.Pm）、钙盐沉积率（MAR）、骨表面新骨形成率（BFR/BS）和骨转换率（BRF/BV）有下降趋势，新骨年形成率（BFR/TV）下降62.8%（P<0.05），成骨细胞周长百分数（%Ob.S.Pm）减少45.7%（P>0.05），破骨细胞周长百分数（%Oc.S.Pm）、破骨细胞数量（Oc.N）无明显变化。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组破骨细胞周长百分数及破骨细胞数量降低（P<0.05）；环黄芪醇中剂量组骨小梁面积百分数增加20.5%、骨小梁厚度增加3.4%、骨小梁数量增加14.3%，骨小梁分离度有下降13%，荧光周长百分率下降37.6%、钙盐沉积率下降8.9%、骨表面新骨形成率下降43.9%、骨转换率下降45.7%、新骨年形成率下降25.1%、成骨细胞周长百分数增加44.6%，但差异无统计学意义（P>0.05），破骨细胞数量、破骨细胞周长百分数有下降趋势。胫骨上段松质骨二维形态计量学结果提示，模型组骨量减少，骨代谢活动下降，具有低转换型骨质疏松的特征；环黄芪醇低剂量组有抑制骨吸收的作用；环黄芪醇中剂量组有促进骨形成、抑制骨吸收、增加骨量的趋势。
7.胫骨中段皮质骨二维形态计量学结果显示，与年龄对照组相比，模型组皮质骨面积（Ct.Ar）上升18.1%（P<0.05），骨外膜荧光标记百分数（%P-L.Pm）下降44.9%，骨内膜荧光标记百分数（%E-L.Pm）下降23.4%，但差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组骨外膜荧光标记百分数上升114.4%（P<0.05），骨内膜荧光标记百分数上升27.4%，但差异无统计学意义（P>0.05）；环黄芪醇中剂量组骨外膜荧光标记百分数上升88.1%，骨内膜荧光标记百分数上升30.1%，但差异无统计学意义（P>0.05）；环黄芪醇高剂量组骨外膜荧光标记百分数上升123.1%（P<0.05），骨内膜荧光标记百分数上升51%，但差异无统计学意义（P>0.05）。胫骨中段皮质骨二维形态计量学结果提示环黄芪醇低、高剂量组具有促进骨形成和矿化的作用。
8.三维图像计量学结果显示，与年龄对照组相比，模型组连接密度（Conn-Dens）降低（P<0.05），结构模型指数（SMI）上升（P<0.05），骨密度（BMD）下降（P<0.05），骨体积分数（BV/TV）下降65.1%（P<0.05），骨小梁数量（Tb.N）下降53.8%（P<0.05），骨小梁厚度（Tb.Th）下降26.4%（P<0.05），骨小梁分离度上升221.5%（P<0.05）。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组连接密度、骨密度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度有上升趋势，骨小梁分离度、结构模型指数有下降趋势，但差异均无统计学意义（P>0.05）；环黄芪醇中剂量组骨小梁厚度增加18.9%（P<0.05），结构模型指数下降33%（P<0.05），连接密度上升51.4%，骨密度增加25%，骨体积分数升高71.2%，骨小梁数量增加40.9%，骨小梁分离度下降29.9%，但差异无统计学意义（P>0.05）。三维图像计量学结果提示环黄芪醇中剂量组可增加自然衰老大鼠的骨小梁厚度，改善骨小梁结构。
9.蛋白组学鉴定出4332种蛋白质，与年龄对照组相比，模型组共803差异表达蛋白质，其中373蛋白表达上调，430蛋白质表达下调。与模型组相比，环黄芪醇中剂量组共80差异表达蛋白质，其中26蛋白质上调，54蛋白下调。差异表达蛋白GeneOntology（GO）功能富集分析及通路富集分析发现，与年龄对照组相比，模型组增殖、分化及免疫调节相关功能、通路发生显著变化（P<0.05），免疫相关蛋白质下调多于上调，提示免疫衰老，骨激活素（Osteosctivin，OA），又名非转移性黑色素瘤糖蛋白B（Glycoproteintransmembranenonmetastaticmelanomaproteinb，GPNMB）有表达下调的趋势；与模型组相比，环黄芪醇中剂量组抗原提呈相关功能蛋白表达上调，主要组织相容性复合体Ⅱ（RT1-Bb、RT1-Da、RT1-Db1）表达上调（P<0.05），KEGG通路富集分析结果显示金黄色葡萄菌感染、系统性红斑狼疮症、类风湿性关节炎等免疫相关通路发生显著变化（P<0.05），免疫相关蛋白质上调多于下调，GPNMB表达上调（P<0.05）；雌激素信号通路蛋白--Kras表达上调（P<0.05）。以上结果提示环黄芪醇可能通过上调GPNMB表达及增强免疫细胞抗原提呈能力，延缓免疫衰老，同时通过E2/Kras信号通路起拟雌激素作用。
10.蛋白免疫印迹法结果显示，与年龄对照组相比，模型组GPNMB表达有下降趋势，MEK1/2表达无明显变化。与模型组相比，环黄芪醇低剂量组GPNMB、MEK1/2表达无明显变化；环黄芪醇中剂量组GPNMB表达增加（P<0.01），MEK1/2表达增加（P<0.05）。环黄芪醇高剂量组GPNMB表达无明显变化，MEK1/2表达增加（P<0.05）。结果提示环黄芪醇能促进MEK1/2表达、GPNMB分泌，这种作用可能与环黄芪醇激活端粒酶、延缓免疫衰老有关。
[结论]
1.在SPF级环境饲养雌性SD大鼠至21月龄能成功复制自然衰老骨丢失模型，与年龄对照组相比，主要表现为体重增长缓慢，股骨重量指数、骨密度下降，骨小梁骨量减少，厚度减少，分离度上升，骨小梁网状结构破坏，骨形成和骨吸收活性下降，属于低转换型骨质疏松。
2.环黄芪醇具有预防自然衰老雌性大鼠骨组织衰退作用，其中低剂量环黄芪醇能抑制骨吸收，促进皮质骨内外膜骨矿化，增强骨生物力学性能。中剂量环黄芪醇能增加骨小梁厚度，保持骨小梁网状结构，抑制自然衰老引起的骨小梁骨质量下降。
3.环黄芪醇能上升血清E2浓度，增加子宫浆膜厚度，有一定对抗自然衰老性子宫衰退的作用。
4.环黄芪醇抗自然衰老骨质疏松的机制可能与激活端粒酶，促进骨髓微巨噬细胞分泌GPNMB，抗免疫细胞衰老，从而抑制破骨细胞、增强成骨细胞和间充质干细胞活性有关。也可能与其激动E2/Kras信号通路所引起的拟雌激素作用有关。