研究背景：人类格林-巴利综合征(GBS)是引起神经肌肉麻痹的普遍原因,而急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP),其最常见的类型,为一种自身免疫性疾病,临床上主要累及外周神经系统(PNS),而发病机制主要由CD4+T细胞参与介导。实验性自身免疫性神经炎(EAN)是公认的研究人类AIDP的动物模型,在易感动物中,通过外周神经系统中同种抗原的免疫(如BPM、PO等)可以诱导EAN的发生。树突状细胞(DCs)是经典的抗原递呈细胞,能够启动和调控免疫反应,与活化的DCs相比,未成熟的DCs,特征是其表面共刺激分子如CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子下调,在免疫调节中通过多种效应机制起作用,而且,它能够诱导T细胞的低反应性,这种现象已经被人们用于控制某些自身免疫性疾病的研究,比如说1型糖尿病(type-I diabetes)及类风湿关节炎(RA)。近二十年间,研究者们尝试用不同的方式创造能够诱导免疫耐受的DCs,统称为“耐受性DCs",这些研究大都应用于动物模型,包括实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE),实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)及实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)等。在体外修饰产生耐受性DCs的方式很多,最常见有效的是应用免疫抑制剂,例如应用IL-10, TGF-β等,而利用免疫抑制药物对DC功能进行药理调节进而诱导耐受性DCs产生的方式也做过广泛研究。包括阿托伐他汀在内的他汀类药物,在胆固醇生物合成的甲羟戊酸途径中可以竞争性抑制HMG-CoA还原酶(胆固醇合成过程中的一种关键酶),临床上广泛用于治疗动脉粥样硬化性疾病和高脂血症。研究表明他汀类药物具有免疫调节和抗炎作用,尤其可以抑制DCs的分化和成熟,我们的前期试验发现：阿托伐他汀可以抑制脾源性DCs的成熟,其表面协同刺激分子CD80和CD86表达明显下降,而且经他汀修饰的DCs可以减轻EAMG的症状和体内炎症,表现为调节性T细胞(Treg cells)的上调,Th1/Th17型细胞因子向Th2型细胞因子的转变。他汀修饰的DCs对EAN或GBS有无免疫调节作用,到目前为止还没有相关报道。在本研究中,我们在体外通过阿托伐他汀修饰DCs使之具有诱导免疫耐受的功能,在发病的起始阶段,利用上述DCs对EAN大鼠给予干预,结果发现阿托伐他汀修饰的DCs对EAN大鼠有保护作用,其机制主要与外周淋巴结中Treg细胞数量和胸腺中Foxp3阳性细胞数量的上调、外周淋巴结中NK细胞及NKT细胞数目的上调、Thl/Th17型细胞因子的降低、外周神经系统炎性细胞浸润减少及淋巴细胞增殖的抑制等有关。研究目的：探讨阿托伐他汀修饰的DCs对实验性自身免疫性神经炎的治疗作用及免疫调节机制。研究方法：1.建立EAN模型并临床评估提取BPM,并完全溶于弗氏不完全佐剂(IFA)和H37Ra株结核分枝杆菌中以配制抗原,在大鼠双后足垫皮下注射上述充分混匀的抗原,每只大鼠用量为200μl,以免疫动物造模。免疫当天定为第0天,每天对大鼠的症状进行观察并临床评估(双盲法观察)直至免疫后第14天。2.耐受性DCs的制备及鉴定取健康Lewis大鼠的脾脏(注意无菌操作),通过研磨以制备单个核细胞悬液。破红细胞膜后,在37℃、5%CO2条件下,将置于培养瓶中的细胞液培养2h。弃悬浮细胞,留取贴壁细胞,加入完全培养基于上述条件下继续培养。18h后向培养瓶中加入溶于二甲基亚砜(DMSO)的阿托伐他汀(终浓度10μM),对照培养瓶中加入等体积的DMSO。培养48h后收集悬浮的细胞分别标记为他汀修饰的DCs (statin-DCs)和未经他汀修饰的DCs(untreated-DCs)。通过流式检测不同组DCs表面CD80、 CD86、 MHC-II分子。3.动物分组及干预将EAN大鼠随机分为三组,每组五只,在免疫第五天,治疗组分别给予他汀修饰的DCs、未经他汀修饰的DCs腹腔注射,每只大鼠注射的细胞数为1×106个,对照组(control group)给予等体积的1640培养基腹腔注射。4.制备淋巴结单个核细胞(MNC)在EAN发病高峰期处死大鼠,在无菌条件下取其腹股沟淋巴结,研磨淋巴结,制备MNC并计数,将细胞浓度调整为2×106个细胞/ml。5.流式细胞仪检测淋巴结单个核细胞表面的CD80、 CD86及MHC-Ⅱ取淋巴结MNC,洗涤后分别加入FITC标记的小鼠抗大鼠CD86和MHC-II抗体,以及PE标记的小鼠抗大鼠CD80抗体,经孵育、重悬、过滤等步骤,流式细胞仪检测。6.流式检测NK和NKT细胞取淋巴结MNC,洗涤后分别加入FITC标记的小鼠抗大鼠CD3抗体和PE标记的小鼠抗大鼠CD161a抗体,经孵育、重悬、过滤等步骤,流式细胞仪检测。7.流式检测Th1/Th2/Th17型细胞因子取淋巴结MNC,经洗涤、固定、破膜等步骤,分别加入PE标记的小鼠抗大鼠IL-10抗体、FITC标记的抗大鼠IFN-γ抗体、PE标记的抗大鼠TNF-α抗体和FITC标记的抗大鼠IL-17A抗体,经孵育、重悬、过滤等步骤,流式细胞仪检测。8.流式检测Treg细胞取淋巴结MNC,洗涤后分别加入PE标记的抗CD25抗体(小鼠抗大鼠)和FITC标记的抗CD4抗体(小鼠抗大鼠),4℃条件下孵育30min,避光,洗涤后加入固定／破膜工作液并混匀,4℃孵育过夜,避光。洗涤细胞后加入PE-Cy5标记的Foxp3抗体4℃孵育30min,重悬、过滤后,流式细胞仪检测。9.淋巴细胞增殖实验将同组细胞悬液以同样比例混合,加入0.5μl CFSE,37℃避光孵育30min,加入预冷的1640,置于冰上孵育5min；离心弃上清后加入完全培养基,以相同细胞数种于24孔板,分别加入刺激物BPM或ConA,置于37℃、5%CO2条件下培养72h；将24孔板中的细胞分别收集到流式管中,离心5min (1200rpm/min),弃上清后混匀；洗涤后加入PE标记的抗大鼠CD4抗体,经孵育、重悬、过滤等步骤,流式细胞仪检测。10.组织病理学检测在发病高峰期即免疫后第14天,处死大鼠后取坐骨神经,10%多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,依次经脱蜡、水化、苏木素染色、0.5%伊红液染色、脱水、透明、封片等步骤,显微镜下观察坐骨神经中炎性细胞的浸润情况并计数。11.胸腺免疫组化检测大鼠胸腺石蜡包埋后切片,常规脱蜡、水化,柠檬酸盐抗原修复,H202消除内源性过氧化物酶,滴加稀释好的一抗,大鼠抗小鼠/大鼠Foxp3,4℃过夜。复温后洗涤,滴加HRP标记的羊抗大鼠二抗,37℃孵育1h,洗涤后DAB显色,苏木素复染,脱水、透明、封片。显微镜下观察大鼠胸腺中Foxp3+细胞的情况并计数。研究结果：1.阿托伐他汀对DC表型的影响他汀修饰的DCs较未经他汀修饰的DCs表面共刺激分子CD80和CD86的表达明显降低,而MHC-II分子没有显著性差异。2.三组大鼠的发病情况与临床评分与对照组相比,他汀修饰的DCs在免疫的第11到第14天,明显缓解了EAN大鼠的临床症状；而与未经修饰的DCs相比,他汀修饰的DCs在免疫的第12到第14天,明显减轻了EAN大鼠的临床症状；对照组与未经他汀修饰的DCs治疗组的临床评分之间无明显差异。3.阿托伐他汀修饰的DCs治疗减少EAN大鼠坐骨神经中的炎性细胞他汀修饰的DCs治疗组中EAN大鼠坐骨神经中炎性细胞较未处理DCs治疗组及对照组明显减少。4.阿托伐他汀修饰的DCs治疗下调EAN大鼠淋巴结单个核细胞上CD80、 CD86和MHC-Ⅱ的表达。与对照组相比,他汀修饰DCs治疗组中EAN大鼠淋巴结单个核细胞上CD80、 CD86及MHC-II均显著降低；与未处理DCs治疗组相比,上述指标亦有降低,但是没有显著性差异。而且,淋巴结单个核细胞上CD80和CD86在对照组中和未处理DCs治疗组中没有显著性差异,但是MHC-II在未处理DCs治疗组中明显降低,与对照组相比。5.他汀修饰的DCs治疗降低了EAN大鼠淋巴结单个核细胞中Thl和Thl7型细胞因子的表达与对照组相比,他汀修饰DCs治疗组中EAN大鼠淋巴结单个核细胞中的IFN-γ, TNF-α和IL-17A均显著降低；与未处理DCs治疗组相比,IL-17A和TNF-α降低,但无显著性差异；同时与对照组相比,未处理DCs治疗组中IFN-γ和TNF-α显著下降,而IL-17A在这两组中无显著性差异；三组之中,IL-10没有显著性差异。6.他汀修饰的DCs上调了淋巴结单个核细胞中NK和NKT细胞的数量与对照组和未处理DCs治疗组相比,CD3-CD161a+NK细胞在他汀修饰DCs治疗组明显升高；与另外两组相比,CD3+CD161a+NKT细胞在他汀修饰的DCs治疗组也有升高,而且与对照组之间有显著性差异,而与未处理DCs治疗组无显著性差异。7.他汀修饰的DCs上调了淋巴结单个核细胞CD4+Foxp3+Treg细胞的数量与对照组及未处理DCs治疗组相比,他汀修饰的DCs上调了淋巴结单个核细胞中CD4+Foxp3+Treg细胞的数量；而在其他两组之间未发现CD4+Foxp3+Treg细胞数量有显著性差异。8.他汀修饰DCs上调了胸腺中Foxp3+细胞的数量与对照组及未处理DCs治疗组相比,他汀修饰DCs治疗组中胸腺Foxp3+细胞的数量明显增加；另外两组中Foxp3+细胞数量无显著性差异。9.他汀修饰的DCs治疗抑制了淋巴细胞增殖反应与对照组及未处理DCs组相比,他汀修饰DCs显著抑制了淋巴细胞增殖反应,无论是在BPM抗原刺激的情况下,还是ConA抗原刺激的情况下；我们没有发现在对照组和未处理DCs治疗组之间,淋巴细胞增殖有显著性差异。结论：1.阿托伐他汀可诱导DCs成为耐受性DCs。2.阿托伐他汀修饰的DCs干预,可以减轻实验性自身免疫性神经炎的症状。3.阿托伐他汀修饰的DCs在实验性自身免疫性神经炎中可诱导中枢(胸腺)和外周(淋巴结)免疫耐受。意义：本研究通过阿托伐他汀诱导DCs成为耐受性DCs,给予EAN大鼠腹腔注射,显示他汀诱导的耐受性DCs能够减轻EAN的症状并诱导免疫耐受,这种作用主要是通过抑制淋巴结单个核细胞表面共刺激分子(CD80和CD86)及MHC-Ⅱ的表达、降低Thl/Th17型细胞因子、上调淋巴结中Treg细胞及胸腺中Foxp3细胞的表达及上调淋巴结单个核细胞中NK及NKT细胞数量实现的。本研究为人类GBS的治疗提供了新的思路。