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研究背景随着蛋白芯片,尤其是免疫芯片(immunochip)等技术的飞速发展,越来越多新的自身抗原抗体系统逐渐被发现。有研究表明,肽酰精氨酸脱亚胺酶4 (PADI4)和鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1 (BRAF)的催化结构域为两种新的类风湿关节炎(RA)相关的自身抗原。研究新型自身抗原对应的自身抗体可对RA的诊断和治疗提供新的方法和思路。我室通过动物模型证实,当雌性机体同时接受两种不相关抗原的刺激时,体内易于产生针对该两种抗原的天然双特异抗体。自身免疫病与我们所建立的双特异抗体动物模型具有一定的共通性,如多发于女性,体内在慢性进行性病程中接受不同自身抗原的刺激等。因此,我们推断在自身免疫病患者体内可能存在针对不同自身抗原的双特异自身抗体。研究目的1.检测RA患者和对照血清中的IgG抗PADI4抗体、IgG抗BRAF催化结构域抗体和IgG抗P25抗体的分布,并了解这些自身抗体与RA临床和实验室指标的联系。2.测定RA患者血清IgG抗PADI4抗体业型分布并了解其与疾病的关系。3.在RA患者血清中鉴定一种抗免疫球蛋白G (IgG)和抗环瓜氨酸肽(CCP)的天然双特异自身抗体。方法1.利用原核表达载体pDEST17-PADI4在大肠杆菌原核表达系统中进行PADI4蛋白的可溶性表达,并采用Ni2+亲和层析纯化目的蛋白。2.采用间接酶联免疫吸附检测(ELISA)方法检测RA、系统性红斑狼疮(SLE)、原发性干燥综合征(pSS)、系统性硬化症(SSc)患者以及健康人血清中IgG抗PADI4抗体,并分析抗体与RA患者临床和实验室指标的联系。3.通过建立四种辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG业型单克隆抗体的" equipotency "曲线,检测RA患者血清IgG抗PADI4抗体亚型的分布。4.PCR方法扩增野生型BRAF催化结构域序列并将其克隆入原核表达载体pET28b,获得重组表达载体pET28b-BRAF。5.利用原核表达载体pET28b-BRAF在大肠杆菌原核表达系统中进行BRAF催化结构域包涵体形式表达,通过包涵体的分离和Ni2+亲和层析纯化目的蛋白。6.采用间接ELISA方法检测RA、SLE、pSS患者以及健康人血清中IgG抗BRAF催化结构域抗体以及抗多肽P25抗体,并分析这两种自身抗体与RA患者临床和实验室指标的联系。7.采用CCP和HRP标记的兔IgG建立双抗原夹心ELISA方法鉴定RA患者血清抗IgG和抗CCP(抗IgG/CCP)的双特异自身抗体。结果1.通过原核表达和纯化获得了高纯度的重组人PADI4蛋白和BRAF催化结构域蛋白。2.RA患者IgG抗PADI4抗体的阳性率(32.0%)显著高于SLE (6.0%; p<0.OO1)、pSS (8.6%; p=0.003)、SSc (5.0%; p=0.017)以及健康人(2.0%；p<0.001)；而RA患者IgG抗BRAF催化结构域抗体和抗P25抗体的阳性率(分别为20.8%和18.8%)虽显著高于健康人(分别为6.4%和2.2%,p均小于0.001),但与SLE(分别为20.3%和21.2%)或pSS(分别为20.5%和18.2%)患者的阳性率并没有差异。3.RA患者血清IgG抗PADI4抗体最主要的亚型为IgG1和IgG3。4.统计学分析表明,IgG抗PADI4抗体与患者的疾病活动性以及其他自身抗体如抗CCP抗体等存在一定联系,其业型的分布在活动期患者和非活动期患者间存在差异；IgG抗BRAF催化结构域抗体和IgG抗P25抗体与RA患者的炎症性指标如血沉以及患者的疾病活动性具有关联性。5.经鉴定,RA患者血清中存在一种抗IgG/CCP双特异自身抗体。结论1.IgG抗PADI4抗体是一种RA特异的自身抗体,本课题首次对其亚型分布进行了测定,结果显示其主要业型为IgG1和IgG3,进一步丰富了IgG抗PADI4抗体在RA中的研究内容。2.本课题首次检测了较大样本量的RA以及其他自身免疫病患者血清IgG抗BRAF催化结构域抗体和抗P25抗体,结果显示这两种自身抗体均为RA非特异的自身抗体,但他们与RA患者的炎症性指标具有一定联系,因此可认为这两种抗体为RA相关的自身抗体。3.我们首次在RA患者血清中报道了一种天然的抗IgG/CCP双特异自身抗体,为进一步研究该抗体在疾病中的意义奠定了基础。