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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的传染性疾病,PRRSV作为一种单股正链RNA病毒,其基因组具有较高的变异性,使用传统的疫苗控制来改善PRRSV的流行具有较大困难。通过深入的研究了解PRRSV的致病机制及宿主基因对PRRSV的作用,从遗传水平上提高猪抗病力,对猪蓝耳病防治具有重要的意义。本课题组前期通过对通城猪和大白猪人工感染PRRSV发现通城猪IFN-γ感染后第5天和第7天显著上升,而大白猪感染前后无变化。并且对猪肺泡巨噬细胞(PAMs)进行转录组测序,发现了两品种猪感染前后大量差异表达基因。集中IFN-γ通路筛选了多个诱导基因为候选基因,并利用MARC-145细胞系进行功能研究。主要研究结果如下:1 利用生物信息学方法对人工感染通城猪和大白猪PRRSV后差异表达基因进行分析,同时以他人IFN-γ处理的PAMs获得的RNA-Seq数据(NCBI:SRR1047809)分析结果为参考,筛选出通城猪感染前后与IFN-γ相关的18个差异表达基因;利用qRT-PCT方法检测了不同品种猪感染前后PAMs细胞中ISG12A OASLmRNA的表达变化,结果发现均上调表达,与RNA-Seq数据结果一致,证明RNA-Seq数据及生物信息学分析结果可靠,确定了以ISG12A、OA4L为本研究的目的基因。2.猪ISG12A基因与人和猴相比在5’端含有一段特有的序列,氨基酸序列C端含有共同的ISG12基序,确定了它们是同源基因;进化树分析发现,猪与猴ISG12A具有较远的亲缘关系,而与牛、羊亲缘关系最近;亚细胞定位发现ISG12A定位到线粒体上;通城猪感染PRRSV后ISG12A在脾脏、肺脏和淋巴组织中均上调表达,但差异并不显著;大白猪表现出同样的趋势,在脾脏和肺脏中显著上调表达;体外MARC-145细胞中超表达或干扰ISG12A24h后感染PRRSV(WUH3毒株)一定时间后收取细胞。qRT-PCR结果发现:超表达猪ISG12A的细胞在感染后24h、36h、48h PRRSV ORF7 mRNA水平均极显著的低于对照组;MARC-145细胞中干扰内源ISG12A后,PRRSV ORF7mRNA含量显著高于对照组。利用间接免疫荧光法检测结果发现:超表达或干扰ISG12A后细胞中PRRSV-N蛋白含量极显著的低于或高于对照组。验证了 MARC-145细胞中超表达猪ISG12A能显著的抑制PRRSV在细胞中的增殖;超表达ISG12A能显著的降低MARC-145细胞处于G2/S期的数量,而已有的研究表明该时期的MARC-145细胞具有更高的PRRSV易感性。所以,ISG12A可能通过改变细胞周期状态来降低细胞对PRRSV的易感性,而抑制病毒增殖。3 本研究成功构建了三种不同的真核表达载体猪OASL(pRK-flag-pOASL)、猴 OASL(pRK-flag-mOASL)、重组型 OASL(含有猪 OAS-like domain 和人UBL domain,pRK-flag-rOASL),用于后续基因功能的研究;通过在MARC-145细胞中瞬时转染3种不同质粒和空载(pRK-flag),感染PRRSV后不同时间点收取细胞。qRT-PCR检测结果发现:猴OASL在感染12h开始PRRSVORF7 mRNA含量显著低于对照组;猪OASL和重组型OASL在感染24h开始PRRSV ORF7 mRNA含量显著低于对照组。间接免疫荧光检测结果发现:转染不同OASL的细胞中PRRSV-N蛋白含量均显著低于对照组。说明OASL能显著抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制,猪OASL抑制病毒复制可能不依赖类泛素结构域,其作用机制尚待进一步研究。本研究利用RNA-Seq数据初步筛选了通城猪感染前后与IFN-γ相关的差异表达基因,并在体外MARC-145细胞中进行了初步验证:ISG12A、OASL能够抑制PRRSV在细胞中的增殖,为后续的研究提供了基础依据。