小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的粮食作物之一。小麦在生长发育过程中经常受到各种逆境胁迫,特别是盐胁迫。泛素/26S蛋白酶体系统(UPS)是植物中最重要的蛋白质周转系统。该系统主要由泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、26S蛋白酶体和泛素组成。研究发现UPS参与许多生物学过程,包括信号转导、细胞周期和逆境胁迫响应等。本实验室前期从小麦中克隆了U-box型E3连接酶基因,命名为TaPUB1。为深入研究该基因在小麦盐胁迫耐性中的功能,本研究中我们转化了小麦,获得了过表达和沉默TaPUB1转基因小麦株系。鉴定了转基因小麦株系的耐盐性,并分析了其生理及分子机制。主要结果如下:(1)通过PCR和qRT-PCR检测分析,对转基因小麦进行筛选鉴定,选择两个过表达株系(TaPUB1-OE3和TaPUB1-OE6)和两个沉默株系(TaPUB1-RNAi1和TaPUB1-RNAi5)进行后续实验。(2)对不同生育年龄的转基因小麦进行盐胁迫处理,结果发现,与野生型(WT)相比,过表达TaPUB1的小麦株系在盐胁迫下生长抑制程度低,幼根和幼叶生长快。而沉默株系则相反。与WT相比,盐胁迫下过表达株系成苗的光合能力更强,沉默株系光合能力相对较弱。结果表明TaPUB1基因在小麦的耐盐性方面起正调控作用,过表达该基因可以提高小麦的耐盐性。(3)从离子毒害方面分析了转基因和WT小麦的Na~+,K~+离子积累以及离子在膜内外的流动情况。结果表明,盐胁迫下,过表达株系的Na~+含量较WT低,而K~+含量较WT高,进而导致过表达小麦的Na~+/K~+较WT低,而沉默小麦株系的Na~+/K~+较WT高。随后检测了细胞膜内外Na~+、K~+和H~+动态流动,发现过表达TaPUB1能促进小麦细胞的Na~+外流和减少K~+外流,这与TaPUB1能够调节小麦细胞中低Na~+高K~+的结果相对应。(4)从生理生化和分子水平分析了转基因小麦的耐盐性机制。结果发现与WT相比,盐胁迫下过表达小麦中ROS含量低于WT,沉默株系中ROS含量高于WT;过表达小麦株系中MDA含量以及电解质外渗率量也低于WT,而沉默株系的MDA含量以及电解质外渗率量与过表达恰恰相反。在盐胁迫下过表达植株的多种抗氧化酶活性高于WT,而沉默株系则相反。这些结果表明在盐胁迫下TaPUB1可能通过提高抗氧化酶的活性来减少ROS的积累,减轻氧化胁迫,从而提高小麦的耐盐性。(5)检测了转基因植株中某些盐胁迫抗性相关、离子转运相关和ROS清除相关基因的表达。结果发现大部分被检测基因的表达量在过表达株系中上调表达。这可能是过表达该基因提高小麦耐盐性的重要机制之一。(6)通过酵母双杂筛库,我们得到一个与TaPUB1在核中互作的蛋白TaMP,该基因编码α甘露糖苷酶。将此基因在短柄草中过表达,结果发现转基因短柄草表现出对盐胁迫敏感的表型。表明TaMP基因能够负调控短柄草的耐盐性。根据以上结果得出,TaPUB1调节小麦盐胁迫耐性可能有以下通路:在生理生化方面上,TaPUB1可能通过诱导离子转运体的活性,调节细胞内Na~+、K~+和H~+在细胞内外的流动,在盐胁迫下维持较低的细胞质Na~+/K~+比。同时,TaPUB1还可以通过增加抗氧化酶活性,降低盐胁迫下细胞ROS水平,减轻氧化胁迫,进而增强小麦耐盐性。在分子水平上,TaPUB1可能在细胞核中与某些转录相关蛋白互作,进而影响盐胁迫相关基因的表达。TaMP是小麦盐胁迫反应的负调节因子,而TaPUB1在细胞核中与TaMP相互作用。