论文部分内容阅读
目的:探索2型糖尿病（T2DM）患者外周血中环状RNA（circRNA）的差异性表达,寻找T2DM的诊断标志物,并初步探索环状RNA与下游miRNA的作用机制。方法:采用微阵列分析从3个正常人和3个T2DM患者外周血中严格筛选出数个差异表达circRNAs。扩大样本量（对照组（NC）20人,糖调节异常（IGR）20人,2型糖尿病（T2DM）20人）,利用荧光定量PCR（Q-PCR）测定,进一步筛选差异性最明显的一个circRNA,对确定的circRNA再进行扩大样本验证（50个NC、50个IGR和50个T2DM样本）。根据生物信息学对差异表达最明显的环状RNA进行下游作用的miRNA进行预测,并采用双荧光素酶报告基因实验,构建含有双荧光素酶基因和目的基因克隆载体,与miRNA模拟物共同转染进293T细胞中,通过观察荧光活性来判断环状RNA与miRNA的结合效率。结果:微阵列分析共发现2953个差异表达的circRNAs,其中表达上调的为1439个,表达下调的为1514个。从表达上调的1439个环状RNA中严格筛选出9个差异表达的circRNAs（hsa-circ-103838,hsa-circ-103965,hsa-circ-104227,hsa-circ-002117,hsa-circ-000094,hsa-circ-101226,hsa-circ-101720,hsa-circ-400029,hsa-circ-100633）作为候选诊断标志物。扩大样本后（n=60）Q-PCR结果显示9个circRNAs中hsa-circ-000094（别名:hsa-circ-0000247）在三组人群中差异表达最明显,通过ROC曲线分析发现其具有最大曲线下面积（AUC）,SIGR=0.8025（95%置信区间[0.6655-0.9395],p=0.001）;ST2DM=0.77（95%置信区间[0.624-0.916],p=0.003）。为了进一步验证Hsa-circ-000094的临床诊断能力,进行再扩大样本（n=150）实验,结果显示Hsa-circ-000094在三组人群中的表达具有差异性,差异性及ROC曲线分析具有统计学意义,SIGR=0.6733（95%置信区间[0.5757-0.7710],P<0.001）;ST2DM=0.7231（95%置信区间[0.6327-0.8134],P<0.001）。根据生物信息学预测结果,我们筛选了5个与Hsa-circ-000094相关性最密切的miRNA（hsa-miR-98-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-370-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7a-5p）。双荧光素酶报告基因实验结果显示Hsa-circ-000094与hsa-miR-370-5p共转染进293T细胞中之后荧光蛋白表达量降低,荧光活性降低约40%左右（P<0.0006）,同时与hsa-let-7e-5p共转染进293T细胞中之后荧光活性降低约20%左右（P<0.0018）,根据结果说明Hsa-circ-000094与hsa-miR-370-5p有更好的结合效率。结论:外周血hsa-circ-000094的高表达对IGR和T2DM提供了一定的诊断依据。Hsa-circ-000094可通过海绵吸附作用于miR-370,抑制其活性,并影响脂代谢的合成,影响糖尿病的发展。