目的:A群链球菌(Group A streptococcus,GAS)是临床上最常见的致病性革兰阳性菌之一,可引起化脓性感染、中毒性疾病和多种自身免疫性疾病。在我国5个省市进行的流行病学调查研究发现,8 ~ 13岁学龄儿童A群链球菌感染率可高达50%,在部分农村地区甚至达到70% ~ 80%[1]。在所有GAS引起的疾病中,以GAS上呼吸道感染后导致的变态反应性疾病急性肾小球肾炎和风湿热的危害最为严重。由于GAS血清型众多且某些免疫原性强的表面蛋白可能与人的蛋白存在交叉反应,目前还没有理想的疫苗问世[2]。20多年来,多数疫苗研究集中于GAS的M蛋白,虽说它的免疫原性及免疫保护性都很好,但因其血清型众多及其可能诱导有害的自身免疫反应,阻碍了以它为基础的疫苗的应用,近期人们已把目光投向其他GAS表面蛋白。Fba蛋白是一种新发现的表达于GAS表面的蛋白,Terao Y.通过Southern杂交发现其至少存在于GAS的18个血清型中[3]。本室前期研究发现Fba蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护作用[4,5],因此,Fba蛋白有望成为GAS的候选疫苗。本室前期工作中用获得的抗GAS单克隆抗体A8鉴定出Fba作为免疫原的优势氨基酸序列Fba96-118,同时用抗GAS多克隆抗体筛选出了Fba蛋白的15个线性表位。根据此本研究设计了2个由表位串联的肽段,一为已筛选出的Fba蛋白8个优势表位构成的肽段,简称P5,另一为P5和M蛋白无交叉反应型特异性序列相连的重组多肽段P5+Mb。通过PCR获得这两个重组多肽段的核苷酸序列并克隆至载体表达。将克隆表达的肽段免疫动物并攻毒,以确定其保护率。并利用流式细胞术、Real-time PCR、ELISA、HE染色等实验技术检测了表位肽段诱导的细胞免疫和体液免疫的状况。方法:1利用生物信息学方法从噬菌体肽库筛选获得的Fba蛋白的线性表位中筛选出8段优势氨基酸序列,采用搭桥PCR方法串联扩增该基因片段P5并克隆表达。2通过基因序列比对人体组织基因库获得A族链球菌1、3、6、18四个血清型M蛋白型特异性序列,采用搭桥PCR方法串联扩增该基因片段即Mb。3连接P5与Mb基因片段并克隆表达。同时构建Fba全长蛋白基因片段并克隆表达全长蛋白为对照。Western blot鉴定融合蛋白P5+Mb、P5和Fba蛋白。4三段蛋白大量表达纯化后以相同剂量免疫小鼠,设立PBS对照组。每组8只;每次免疫间隔10天,并在下次免疫前内眦取血,共免疫4次,末次免疫后10天攻毒或处死动物。5末次免疫后10天,每组一半动物处死,流式细胞术检测小鼠脾脏CD4+、CD8+细胞的变化。Real-time PCR方法检测小鼠脾脏细胞IL-4、IL-12、IFN-γ细胞因子mRNA表达。ELISA检测各实验组血清IgG水平的动态变化。6用致死量GAS(M+Fba+)攻击免疫后的另一半小鼠,计算各组的保护率。7各实验组小鼠处死后观察其心、肾组织的大体形态变化,HE染色了解疫苗诱导的免疫是否能与小鼠组织发生交叉反应而引起病理改变。同时用GAS感染与实验组同周龄的小鼠,5天后与实验组小鼠一同处死作对照。结果:1成功构建了PET28a-P5+Mb、PET28a-P5和PET28a-Fba的原核表达质粒,并分别得以表达。Western blot结果显示,P5+Mb、P5和Fba蛋白与单克隆抗体A8有明显的杂交。2流式细胞术检测结果显示P5+Mb组的CD4+T细胞、CD8+T细胞水平都显著高于PBS组(P<0.05)。而P5组和Fba组与PBS对照组无显著差异。3 Real-time PCR结果显示IL-4细胞因子水平P5+Mb组显著高于其他组(P<0.05),其他各组之间无差异。IL-12细胞因子水平Fba组著高于PBS组(P<0.05),其他各组与对照组无差异。IFN-γ细胞因子水平P5+Mb组及Fba组均著高于PBS组(P<0.05)。4 ELISA结果显示免疫后小鼠IgG水平逐渐增高,P5+Mb组效价可达到1:407680,P5组效价可达到1:101920,Fba组效价可达到1:203840,三组间效价无显著差异。5攻毒后,PBS组小鼠在3天内全部死亡,而P5+Mb组、Fba组、P5组生存率分别为80%、60%、20% ,经SPSS统计分析各实验组与PBS组保护率有显著差异。6 GAS感染组小鼠心、肾体积明显增大,HE染色显示心瓣膜受损严重,肾小球肾小管组织被破坏,而P5+Mb组、P5组和Fba组与PBS组无显著差异,即疫苗诱导产生的免疫因素对心、肾组织未造成破坏。结论:1、成功构建、表达了P5+Mb、P5多肽和Fba蛋白。2、P5+Mb、P5多肽和Fba蛋白免疫小鼠对GAS感染有保护作用,以P5+Mb更为突出,能产生较强的细胞免疫和体液免疫应答。3、P5+Mb、P5多肽和Fba蛋白疫苗与小鼠心、肾组织无免疫交叉反应。