研究背景慢性阻塞性肺病(COPD)是呼吸系统常见疾病,其主要特征是持续性气流受限。在全球范围内,因COPD出现的残疾和死亡的人数居高不下。虽然COPD急性加重期的症状在合理的抗生素和激素的使用下可以得到适当的缓解,但都难以阻止COPD的发展进程。肺纤维化是多种原因所致的肺功能进行性、不可逆性下降,近年来其发病呈逐年上升趋势,肺纤维化的发病机制尚未明确,缺乏有效的治疗手段,且预后较差,目前临床多用糖皮质激素、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗氧化剂等药物治疗,但临床疗效并不显著,且具有一定不良反应。吸烟是引发COPD的主要危险因素,同时也是诱发肺纤维化的重要因素。除了呼吸系统疾病,吸烟与心脑血管疾病、恶性肿瘤等多种疾病的发生有关。流行病学调查数据显示:虽然近年来吸烟率呈现下降趋势,但被动吸烟状况却依然十分严峻,我国每年死于吸烟相关疾病的人数逐年增长。随着研究深入,人们逐渐发现免疫失衡在慢性气道炎症中发挥了重要作用,其中辅助性T细胞(Th,CD4~+)的免疫失调被认为是COPD、哮喘等多种慢性呼吸系统疾病的发病机制之一。Th细胞参与黏膜炎症的多种免疫反应,并作为免疫调节的中心环节,在发病中的作用至关重要。Th细胞按照所分泌的细胞因子功能差异分为Th1、Th2、Th17、Treg、Th9及Th22等不同亚群,其中Th1及Th2、Th17及Treg两组细胞由于分化过程相互抑制,因此相互之间的平衡对维持免疫稳态至关重要,诸多研究显示调整Th1/Th2、Th17/Treg亚群之间的平衡能够有效控制慢性气道炎症的发生和发展。阿胶(Colla Corii Asini)是我国传统中药,自《神农本草经》首载至今已有两千多年的药用历史。阿胶产生之初原料为牛皮,后因战乱等历史原因变为驴皮并沿用至今,牛皮胶现名黄明胶(Colla Corii Bovis)。阿胶药理功效广泛,在临床多用其补血作用,而对于滋阴润肺作用了解较少。古代本草记载:阿胶具有治疗慢性咳嗽、肺痿(肺纤维化)的功效,现代临床应用于小儿咳嗽、肺结核和支气管扩张中咳血、小儿哮喘和慢性咽炎等慢性气道炎症性疾病也取得较好的治疗效果,但其治疗气道炎症的作用机理尚不明确。依照古籍记载,阿胶治疗肺燥咳嗽的效果要显著优于黄明胶,但这种理论至今没有通过实验数据加以证实。因此,深入研究阿胶、黄明胶对慢性气道炎症的治疗效果及作用机制差异对阿胶功效开发及质量控制研究以及中药治疗慢性呼吸道疾病研究均有重要的意义。鉴于上述背景,本研究首先对历代本草类古籍中阿胶、黄明胶原料及功效相关记载进行系统梳理,在此基础上,采用香烟烟雾暴露法建立气道炎症小鼠模型,评价阿胶和黄明胶对小鼠气道炎症的治疗效果,随后在文献研究的基础上,尝试采用烟雾暴露联合石棉纤维吸入的方法建立肺纤维化小鼠模型,研究阿胶、黄明胶对纤维化病变的抑制作用,在明确治疗效果的基础上,以辅助性T细胞亚群为突破点,研究药物干预对模型动物Th1/Th2和Th17/Treg失衡的调节作用,以及与治疗效果的相关性。第一章 本草考证目的通过对历代本草类古籍中阿胶、黄明胶的记载进行系统梳理,研究阿胶药理功效与原料变更的相关性。方法收集《中药文献学》中涉及的古代本草类文献书目,经图书馆及文献所查阅后筛选具有代表性的文献记载,以阿胶原料明显变更为时间划分依据,将各时间段内文献中阿胶药理功效的相关记载进行汇总比较,研究阿胶原料与功效之间的相关性。结果阿胶原料由产生之初的牛皮变更为现在的驴皮大致经历四个阶段,而各阶段阿胶药效存在明显差异。1.产生之初至唐代:阿胶原料为牛皮,功效以补虚为主;2.唐宋时期:牛皮、驴皮均可作为原料,牛皮胶主要用于补虚,驴皮胶主要用于祛风;3.明代:阿胶原料主要为驴皮,功效主治中增加“补阴清肺”,牛皮胶称黄明胶,主要用于跌打损伤、疮痈肿毒;4.清代:驴皮是唯一原料,牛皮制作的阿胶为伪品。强调阿井水是保证阿胶质量的必要条件,同时是阿胶止咳祛痰的药效物质基础。结论阿胶原料正式定位于驴皮时,功效主治中开始出现治疗“肺燥咳嗽”的记载。且随后多处文献强调阿胶和黄明胶在治疗气道炎症方面存在功效差异,并采用中药药性理论加以阐释。提示明胶治疗“肺燥咳嗽”的疗效可能与原料有关。第二章 阿胶、黄明胶对COPD模型小鼠气道炎症治疗作用研究目的观察阿胶、黄明胶对COPD模型小鼠气道炎症的治疗效果。方法1)64只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、阿胶组和黄明胶组,采用香烟烟雾暴露法建立气道炎症小鼠模型,模型建立同时分别使用阿胶、黄明胶进行药物干预,模型建立及药物干预时间16周;2)观察小鼠一般状态、体重变化、进行外周血白细胞计数;3)每组随机选择8只小鼠取左肺支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数及细胞因子含量测定;4)右肺上叶用4%甲醛固定,制成HE染色病理切片观察炎症浸润情况;5)右肺中、下叶采用ELISA试剂盒检测组织匀浆髓过氧化物酶(MPO)活性;6)采用ELISA试剂盒测定血清炎性介质水平(肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及白细胞介素-10(IL-10))。结果1)模型组小鼠体重增长缓慢,造模结束时体重增幅显著低于对照组(P<0.05),阿胶和黄明胶均能有效增加小鼠体重,且阿胶干预组增重速度较黄明胶组快,但至造模结束时,给药组小鼠体重与对照组均无显著差异(P均>0.05);2)模型小鼠肺脏HE染色切片可见大量炎性细胞浸润,肺脏间质充血水肿、可见红细胞渗出,炎症评分较对照组显著升高(P<0.01)。与模型组相比,阿胶组小鼠气道炎性损伤显著改善,炎症评分显著降低(P<0.01),黄明胶效果不明显(P>0.05);3)模型小鼠BALF中白细胞总数显著升高(P<0.01),其中中性粒细胞和淋巴细胞比例极显著升高(P均<0.01),巨噬细胞比例降低(P<0.01)。阿胶能够显著减少白细胞数目、中性粒细胞和淋巴细胞比例显著降低(P均<0.01),而黄明胶组各类细胞数目降低不显著(P均>0.05);4)模型小鼠肺脏MPO活性显著升高(P<0.01),阿胶干预治疗能使小鼠肺脏MPO活性显著降低(P<0.01),而黄明胶组小鼠肺组织MPO活性无显著变化降低(P>0.05),且显著高于阿胶组(P<0.01);5)模型小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6蛋白表达显著升高(P均<0.01),IL-10水平显著降低(P<0.01)。阿胶组血清IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均极显著降低(P均<0.01),血清IL-10水平显著升高(P<0.01)且与对照组无显著差异(P>0.05)。黄明胶组小鼠血清TNF-α、IL-8水平较模型组显著降低(P<0.01,P<0.05),但显著高于阿胶组(P均<0.01),IL-10因子水平显著升高(P<0.01),但显著低于阿胶组(P<0.01);IL-1β及IL-6因子水平较模型组稍有降低但无统计学意义(P均>0.05)。结论阿胶对于COPD模型小鼠气道炎症有显著的治疗效果,黄明胶对模型小鼠气道炎症评分、血清炎性介质水平、肺脏炎性细胞浸润无明显改善作用,对气道炎症治疗作用不及阿胶。第三章 阿胶、黄明胶对烟雾暴露小鼠辅助性T细胞分泌模式的影响目的研究阿胶、黄明胶对气道炎症小鼠肺脏及脾脏辅助性T细胞亚群免疫失衡的干预作用。方法1)取第二章实验中各组剩余小鼠左肺,剪碎后经胶原酶消化,研磨制成细胞悬液,然后用淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞悬液,经过刺激后以流式细胞术检测肺组织中各Th细胞亚群的变化。脾脏直接研磨后制成细胞悬液经过刺激后以流式细胞术检测组织中各Th细胞亚群的变化;2)右肺上叶匀浆后采用RT-PCR法检测Th细胞各亚群特异性趋化转录因子表达;3)取第二章中收集的小鼠BALF上清液,采用ELISA试剂盒检测与辅助性T细胞分化相关的细胞因子表达。结果1)模型组小鼠肺脏CD3~+、CD8~+细胞比例显著升高(P均<0.01),辅助性T细胞中Th1、Th17亚群比例升高(P均<0.01),Treg亚群比例升高(P=0.276);阿胶组CD3~+、CD8~+细胞比例显著降低,Th1亚群和Th17亚群比例显著降低(P<0.01,P<0.05),Treg亚群比例升高(P<0.05);黄明胶组Th1亚群比例和Th2亚群比例无显著变化,Th17亚群比例和Treg亚群比例均升高但变化不显著;2)模型组小鼠Th1亚群核因子T-bet mRNA转录水平显著升高(P<0.01),Th2亚群核因子GATA-3转录水平升高(P=0.23),Th17亚群趋化转录因子RORγt mRNA转录水平与RORγt/Foxp3 mRNA转录水平相对灰度值比率显著升高(P均<0.01)。阿胶组小鼠肺脏组织T-bet mRNA及RORγt mRNA转录水平均显著降低(P均<0.01),Foxp3 mRNA转录水平显著升高(P<0.01)。黄明胶组T-bet mRNA极GATA-3 mRNA转录水平降低但差异不显著,RORγt mRNA、Foxp3 mRNA转录水平无显著变化;模型组小鼠BALF中IFN-γ、IL-17A因子水平均显著升高(P均<0.01),IL-4、IL-10水平升高但差异无显著性。阿胶组IFN-γ因子和IL-17A因子水平均显著降低(P均<0.01),IL-10因子水平显著升高(P<0.01)。结论COPD模型小鼠存在Th1、Th17亚群优势分化的分化失衡。阿胶可通过抑制Th1、Th17亚群分化,上调调节性T细胞分化及IL-10因子表达,减轻小鼠气道炎症;黄明胶对Th1、Th17亚群优势分化的免疫失衡状态没有明显的干预作用,导致其抑制炎症细胞分泌、改善组织病理损伤的效果不及阿胶。第四章 阿胶、黄明胶对小鼠肺纤维化的防治作用及机制研究目的1)提出一种新的肺纤维化小鼠模型的建立方法,通过肺脏病理切片观察及指标测定,评价该方法的有效性。2)在成功建立肺纤维化小鼠模型基础上研究阿胶、黄明胶对纤维化及气道重塑等病理改变的防治作用。3)研究药物干预前后模型小鼠肺脏辅助性T细胞分化模式,分析阿胶、黄明胶干预辅助性T细胞分化与防治肺纤维化之间可能存在的相关性。方法1)模型建立:64只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、阿胶组和黄明胶组。将5支香烟烟丝与0.1g石棉混合后置于被动吸烟装置中自然燃尽,使模型组和药物干预组小鼠暴露于充满烟丝+石棉颗粒混合烟尘的环境中。每日暴露一次,每次按照上述方法连续点燃2组,暴露时间约30min。阿胶组和黄明胶组小鼠在混合烟雾暴露同时分别使用阿胶、黄明胶进行药物干预,模型建立及药物干预时间16周;2)模型评价:造模结束后,各组随机选取8只小鼠取左肺制作HE染色病理切片和Masson染色病理切片,根据HE染色石蜡切片对各组小鼠肺纤维化程度进行评分,利用IPP6.0图像处理软件对Masson染色病理切片图像进行分析,统计各组小鼠胶原纤维面积、平滑肌厚度病计算支气管平滑肌指数及胶原指数;3)右肺中、下叶匀浆后使用ELISA试剂盒对小鼠肺组织中羟脯氨酸、TGF-β1、Smad3蛋白含量进行测定;4)采用RT-PCR法检测各组小鼠BALF中MMP-2、MMP-9 mRNA表达情况;5)使用ELISA试剂盒对小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-17A、IL-10蛋白含量进行测定;6)取各组剩余小鼠肺脏,剪碎后经胶原酶消化,研磨制成细胞悬液,然后用淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞悬液,经过刺激后以流式细胞术检测肺组织中各Th细胞亚群的变化。结果1)HE染色病理切片显示模型组小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞增生,肺组织ECM增多,肺泡间隔增厚,呈纤维化样改变,且纤维化评分与对照组有显著差异(P<0.01)。肺脏Masson染色病理切片图像分析结果显示:模型组小鼠支气管及肺间质胶原含量明显增多,与正常对照组相比有显著性差异(P<0.01);肺组织羟脯氨酸蛋白含量测定结果显示肺脏组织羟脯氨酸含量显著增加(P<0.01),显示肺纤维化病理改变形成。综合上述结果说明香烟烟丝与石棉粉混合点燃产生的烟雾染毒16周,可以成功建立肺纤维化小鼠模型。2)阿胶组和黄明胶组小鼠肺脏间质胶原含量减少;纤维化评分较模型组降低(P均<0.01);胶原纤维面积、平滑肌厚度、支气管平滑肌指数及胶原指数均有所下降,其中黄明胶组小鼠胶原纤维面积与模型组相比差异均有显著性(P<0.05),与阿胶相比,黄明胶具有更加显著的防治肺纤维化形成的作用。3)肺纤维化小鼠肺脏TGF-β1、Smad3蛋白水平显著升高(P<0.01),黄明胶干预后肺组织TGF-β1因子和Smad3蛋白水平均极显著降低(P<0.01),阿胶组均显著降低(P<0.05),黄明胶对TGF-β1因子的干预作用显著高于阿胶组(P<0.05)模型组小鼠MMP-9转录水平显著降低(P<0.05),MMP-2转录水平升高。与模型组相比,黄明胶组MMP-2转录水平降低,MMP-9转录水平显著升高(P<0.05),阿胶组小鼠肺脏MMP-9表达水平上调,但上调幅度小于黄明胶。4)模型组小鼠肺脏CD8~+细胞比例降低(P<0.05,P<0.05),Th1亚群比例较对照组并没有显著变化,但Th2亚群比例显著升高,Th1/Th2平衡向Th2极化。与模型组相比,黄明胶干预后小鼠肺脏Th1亚群比例上调(P<0.05),Th2亚群比例显著降低(P<0.05),而阿胶组Th1亚群比例升高以及Th2亚群比例降低均无显著性。5)与对照组相比,模型组小鼠肺脏Th17亚群比例降低,Treg亚群比例显著升高,Th17/Treg比率较对照组显著降低。阿胶干预后Th17亚群和Treg亚群比例均无显著变化,而黄明胶组小鼠Th17亚群比例出现显著升高(P<0.05),同时Treg亚群比例显著降低(P<0.05)。6)模型组小鼠IFN-γ表达水平显著降低(P<0.01),IFN-γ/IL-4平衡向/IL-4偏移,IL-17A表达水平降低,IL-10表达水平升高(P<0.05)。阿胶组IL-4、IL-17A因子水平无显著变化,IFN-γ及IL-10因子水平较模型组升高但不显著;黄明胶组IFN-γ水平显著升高(P<0.05),IL-17A因子水平升高,IL-4和IL-10因子水平较模型组显著降低(P<0.05)。结论利用香烟烟丝与石棉粉混合点燃产生的烟尘可以成功诱导小鼠肺纤维化形成。肺纤维化评分、胶原纤维面积、支气管平滑肌厚度、支气管平滑肌指数及肺脏组织羟脯氨酸含量等指标比较结果显示:黄明胶对于小鼠肺纤维化形成的抑制作用优于阿胶。进一步研究显示Th1/Th2、Th17/Treg失衡、TGF-β1、MMP-2、MMP-9表达异常可能参与了肺纤维化的发生。黄明胶通过上调Th1/Th17亚群分化和MMP-9表达、抑制Treg亚群分化并下调TGF-β1、MMP-2表达有效抑制了肺纤维化的发生和发展,而阿胶组小鼠Th亚群分泌模式与模型组无显著差异,TGF-β1、MMP-2、MMP-9表达与模型组差异较小,因此治疗效果不及黄明胶;但阿胶组小鼠肺纤维化程度与模型组相比仍然减轻,可能是由于早期降低炎症反应有关。