研究背景与目的门脉高压症常见于肝硬化,是以门静脉系统血液动力学异常变化为主要特征的综合征,临床常并发致死性上消化道大出血。肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化必经的病理改变。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝纤维化发生、发展的关键细胞。目前研究认为静息型HSC激活转变为活化型HSC,是肝纤维化发生的中心环节。因此,对肝星状细胞增殖、活化机制的研究颇受关注。但国内外从生物力学角度研究HSC增殖活化机制的报道很少。HSC位于肝板与肝窦内皮细胞之间的Disse间隙内。Disse间隙通过肝窦内皮细胞“窗口”与肝窦相联系。在肝纤维化发展过程中,肝窦及Disse间隙压力升高,HSC所受压力增高。胞外压力环境的变化有可能调节HSC的增殖活化及迁移功能。为此,本论文研究目的旨在揭示压力在HSC生物活性中的调节作用,以深入阐明肝纤维化发病机制中压力的重要性,也为肝纤维化的早期干预提供新的思路。本研究在体外应用压力加载模型,模拟门脉高压症发展过程中不同大小的压力,加载压力作用HSC,观察压力对HSC的增殖、活化与迁移功能的影响,并探讨其可能机制。研究共分三个部分:⑴大鼠肝星状细胞的分离鉴定与培养;⑵压力对HSC增殖活化与迁移的影响;⑶压力促HSC增殖活化与迁移的机制研究。方法一、HSC的分离培养与鉴定雄性Sprague-Darwley大鼠(400g-600g),分离门静脉并插管,依次灌注链酶蛋白酶—胶原酶,37℃原位消化,12%Nycodenz密度梯度离心获得HSC,含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中培养,隔天更换培养液。台盼蓝染色鉴定细胞存活率。328nm紫外光下观察HSC自发免疫荧光,免疫荧光检测细胞Desmin与α-SMA表达,鉴定HSC纯度。二、压力对HSC增殖活化与迁移功能的影响㈠压力加载方法采用可重复密闭的钢制圆柱形容器,细胞培养板置于容器内,培养箱内预先培养30min;由入口输入高压氦气,出口通过导管连接血压计以确定加载压力大小。压力加载完毕后,关闭出入口,密闭容器,置于培养箱内保持37℃。㈡HSC增殖活化的检测在6cm培养皿内按1×106 cells/ml密度种植静息与活化HSC,无血清DMEM同步化24小时,不同压力(0mmHg,5mmHg,10mmHg,20mmHg,40mmHg,80mmHg)加载预设时间(1h,12h,24h),培养箱内常压下再培养24小时,CCK-8试剂盒检测细胞增殖率,确定实验细胞及压力加载最适时间;压力加载后1小时提取总RNA,逆转录PCR检测Ⅰ型胶原与α-SMA的mRNA表达;压力加载1小时,常压下再培养24小时后,提取HSC总蛋白,Western-blot检测TypeⅠcollagen、α-SMA和PCNA蛋白表达。㈣HSC细胞周期的检测在6cm培养皿内按1×106 cells/ml密度种植HSC,无血清培养基同步化24小时,按不同压力加载1小时后,在培养箱内常压下再培养24小时,消化收集细胞,PI染色,流式细胞仪检测HSC细胞周期。㈤HSC细胞迁移的检测⒈划痕实验:在6cm培养皿内按1×106 cells/ml密度种植HSC,无血清培养基同步化24小时,用Tip(1ml)尖端同一方向垂直划痕,不同压力加载1小时后,培养箱内常压下再培养24小时,显微镜下拍照,计算细胞迁移率=(作用前划痕内面垂直距离-作用后划痕内面垂直距离)/作用前划痕内面垂直距离×100%。⒉Transwell:在24孔板Transwell小室中按5×103 cells/well密度种植HSC,无血清DMEM同步化24小时,不同压力加载1小时后,培养箱内常压下再培养24小时,含20%FBS的培养基趋化HSC 24小时,结晶紫染色,计算迁移指数=底部细胞数目/(上部细胞+底部细胞)×100%。三、压力促HSC增殖活化与迁移的机制研究选取10 mmHg作用1小时为干预条件,应用特异性阻断剂Herbimycin A(HA,900nM)抑制Src的磷酸化;PD98059(25μM)抑制Erk1/2的磷酸化;LY294002(25μM)抑制Akt的磷酸化;RT-PCR检测β3-integrin,FAK,ILK,ETA,PDGF-B receptor,TGFβ1及TGFβ1 receptor的mRNA表达变化;并用Western-blot分别检测信号通路蛋白Phospho- Src(Tyr418),Phospho-FAK(Tyr397),Phospho-FAK(Tyr576/577),Phospho-Akt (Ser473),Phospho-Erk1/2 (Thr185/ Tyr187),Phospho-p70S6k (Thr421/ Ser424),FAK,p70S6k及增殖活化相关蛋白TypeⅠcollagen、α-SMA和PCNA的表达水平;Transwell方法检测细胞的迁移能力。四、统计学分析数据用均数±标准误表示,数据由SPSS 13.0软件统计包处理。多组间的比较用One-Way ANOVA方差分析:方差齐性用LSD方法比较;方差不齐用Dunnett’s方法比较。P<0.05认为有统计学差异。结果一、HSC的鉴定台盼蓝染色鉴定HSC存活率95%以上;自发荧光及Desmin、α-SMA免疫荧光检测静止与活化HSC细胞纯度达95%以上,能满足实验需要。二、压力对HSC增殖的影响静息(1天)与活化(14天)HSC用于压力加载实验。10 mmHg作用1h明显促进静息与活化HSC增殖(P<0.01); 20mmHg作用1h促进活化HSC增殖(P<0.05);40mmHg作用1h和12h均抑制活化HSC增殖(P<0.05); 80 mmHg作用12h明显抑制静息HSC增殖(P<0.01);40 mmHg与80 mmHg作用24小时均明显抑制静息与活化HSC增殖(P<0.01)。后续实验选择活化HSC,压力作用时间选择1h。三、压力对HSC细胞周期的影响对活化HSC, 10 mmHg与20mmHg作用1小时均能增加S期细胞(P<0.01),且10mmHg最为显著;80 mmHg作用1小时减少S期细胞(P<0.01);不同压力对HSC的G0-G1及G2-M期并无明显影响。四、压力对HSC活化的影响10 mmHg(1h)明显促进a-SMA与TypeⅠcollagen的mRNA与蛋白水平的表达(P<0.01); 40mmHg(1h)与80mmHg(1h)明显抑制HSC的TypeⅠcollagen、α-SMA、PCNA蛋白表达(P<0.01)。五、压力对HSC迁移的影响划痕实验结果表明:10mmHg、20mmHg、40mmHg作用1h,HSC损伤区细胞数目较对照组增多,损伤区域间距缩短(P<0.01),10mmHg最为显著(P<0.05);作用1小时,5mmHg与80mmHg对HSC划痕区域间距无明显影响。Transwell实验结果表明:10mmHg(1h)条件下,HSC迁移指数明显增高(P<0.01),且高于20mmHg(1h)(P<0.01);80 mmHg(1h)条件下,膜下部迁移的HSC数量明显减少(P<0.05)。六、压力对HSC相关信号分子mRNA表达的影响作用1小时,10mmHg明显促进β3-integrin mRNA、FAK mRNA与TGFβ1 mRNA的表达(均P<0.01);40mmHg与80mmHg明显抑制β3-integrin mRNA的表达(均P<0.01)。不同压力(1h)对ETA mRNA、ILK mRNA、PDGF-B receptor mRNA、TGFβ1 receptor mRNA的表达无明显影响。七、压力对HSC Src与FAK磷酸化时间的影响10mmHg作用1h后,在0min,2min,5min,10min,20min,30min,60min,Phospho-Src(Tyr418)与Phospho-FAK(Tyr397)表达时间顺序一致: 2min表达即明显增强(P<0.01),10min表达高峰(P<0.01),并持续到20min(P<0.01),30 min到60min表达减弱至初始水平。结果提示后续磷酸化的蛋白均需在压力作用后10min提取检测较为合适。八、压力对HSC相关信号通路蛋白表达的影响作用1h,5mmHg对各蛋白的磷酸化无明显影响;10mmHg与20mmHg能明显促进Src(Tyr418),FAK(Tyr397),Erk1/2(Thr185/Tyr187), Akt(Ser473),p70S6k(Thr421/ Ser424)的磷酸化(均P<0.01),40mmHg与80mmHg均抑制其磷酸化(均P<0.01);而Phospho-FAK(Try576/577)在40mmHg时仍维持高表达(P<0.01),80mmHg与0mmHg表达水平相当。作用24h,Src(Tyr418),FAK(Tyr397),Akt(Ser473),p70S6k(Thr421/ Ser424),FAK(Try576/577)的磷酸化检测不出,Phospho-Erk1/2(Thr185/ Tyr187)仍有表达。10mmHg对Erk1/2(Thr185/Tyr187)磷酸化无明显影响;20mmHg,40mmHg,80mmHg均能促进Phospho-Erk1/2(Thr185/Tyr187)的表达(P<0.05或P<0.01),80mmHg最为明显(P<0.01)。九、抑制剂对压力所诱导的HSC相关信号通路蛋白表达的影响10mmHg作用1h明显促进Phospho-Sr(cTyr418),Phospho-FAK(Tyr397),Phospho-Akt(Ser473),Phospho-Erk1/2(Thr185/Tyr187),Phospho-p70S6k(Thr421/Ser424)蛋白的表达(均P<0.01);Herbimycin A抑制Src(Tyr418),FAK(Tyr397),Akt(Ser473),Erk1/2(Thr185/Tyr187),p70S6k(Thr421/Ser424)蛋白的磷酸化(均P<0.01);LY294002抑制Akt(Ser473)与p70S6k(Thr421/Ser424)蛋白的磷酸化(均P<0.01),对Phospho-Erk1/2(Thr185/Tyr187)蛋白的表达无明显作用;PD98059抑制Erk1/2(Thr185/Tyr187)蛋白的磷酸化(P<0.01),对Phospho-Akt(Ser473)与Phospho-p70S6k(Thr421/Ser424)蛋白的表达无明显作用。十、抑制剂对压力所诱导的HSC增殖活化相关蛋白表达的影响10mmHg作用1h明显促进PCNA,α-SMA,TypeⅠcollagen蛋白表达(均P<0.01);PD98059对10mmHg促PCNA,α-SMA,TypeⅠcollagen蛋白表达均无明显作用;LY294002与Herbimycin A明显抑制10mmHg促PCNA,α-SMA,TypeⅠcollagen蛋白表达(均P<0.01),且LY294002抑制TypeⅠcollagen蛋白表达作用明显优于Herbimycin A(P<0.01)。十一、抑制剂对压力所诱导的HSC迁移影响10mmHg压力作用明显促进HSC的迁移; PD98059对10mmHg促HSC迁移无明显抑制作用;LY294002与Herbimycin A显著抑制10mmHg促HSC迁移作用(P<0.01)。结论一、压力能显著促进HSC的增殖、TypeⅠcollagen和α-SMA在mRNA与蛋白水平的表达、促进活化HSC的迁移能力,提示病理性升高的肝窦内压力能促进肝纤维化和门脉高压的发展。二、压力促HSC增殖活化与迁移的作用与Integrin相关的FAK(Tyr397)自我磷酸化有关,其上游信号由Src介导,下游信号通过Akt-p70S6k途径传导,与Erk1/2无关。