下颌髁突骨质缺损是临床上常遇到的问题,颞下颌关节骨关节病、颞下颌关节强直、髁突肿瘤、髁突损伤、放射性骨髓炎、颌骨发育不足和畸形等均可造成不同程度的髁突骨质缺损。骨质缺损造成不同程度的颞下颌关节功能障碍,如咀嚼、语言、吞咽等,影响患者的生活质量。髁突骨质缺损后需进行骨质缺损的修复与重建,以恢复其形态和功能。目前修复与重建髁突骨质缺损的方法有:自体骨修复重建,人工合成髁突移植和人工颢下颌关节置换等,这些修复方法虽然有一定的疗效,但是亦存在很多不足,目前尚没有满意的缺损修复方法,因此,迫切需要寻找理想的治疗方法,组织工程学的兴起为髁突骨软骨缺损的修复提供新的治疗途径。　　 组织工程的基本过程包括种子细胞的选择和培养、种子细胞与生物材料复合后联合培养以及细胞/支架复合体植入体内培养三个步骤。一般认为,组织工程的三大要素包括细胞、信号(细胞因子)和支架材料。特殊的生物活性分子和其他物理因子可驱动细胞增殖、分化、游走和分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM),间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能够分化为软骨和骨细胞使得单细胞来源的MSCs构建组织工程骨软骨成为可能。支架是组织工程构建的中心,为细胞的增殖和维持分化功能提供必要的支持,而且支架的结构决定了新的组织工程软骨和骨最终的形态。　　 种子细胞的正确选择是目前组织工程动物实验及其过渡到临床的关键。目前骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨组织工程研究的首选种子细胞,这种细胞在体外增殖能力强,容易在体外分离、培养和扩增；具有多向分化潜能,在适宜的条件下可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞、神经细胞甚至心肌细胞等。但BMSCs也存在纯化率较低、干细胞数量有限、骨髓中干细胞的比例和增殖能力都会随年龄的增长和骨质疏松的发生而逐渐下降等缺点。　　 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种能广泛促进来源于中胚层和神经外胚层细胞(如成纤维细胞、血管内皮细胞、软骨细胞和神经胶质细胞)增殖的生物活性物质,促进某些体外培养细胞的转化,在体内可以促进伤口愈合、血管生成、胚胎发育、肢体再生、神经营养和免疫调节等。但是细胞因子的局部应用存在一些缺点,如细胞因子半衰期很短,局部出血、软组织血液循环可稀释、带走细胞因子,人工提取的细胞因子价格昂贵,反复使用产生中毒和免疫反应等。因此现在一些研究通过基因工程技术和组织工程技术相结合,将细胞因子基因转染细胞,一方面利用移植细胞高效分泌的细胞因子促进骨损伤修复；另一方面移植细胞可增殖、分化,合成细胞外基质,完成修复过程。　　 为了保持和延长生长因子的生物活性,本研究选择人BMSCs作为携带bFGF基因的种子细胞,采用基因转染的方法,将bFGF基因转染到BMSCs,以期获得稳定表达的bFGF。　　 本研究主要目的:①收取人骨髓细胞,通过密度梯度离心分离法和贴壁培养法分离培养BMSCs,并将其分别诱导分化为成骨细胞和成软骨细胞,探讨人骨髓来源MSCs分离、培养和鉴定方法,并探索其诱导条件,为骨组织工程提供种子细胞。②探讨作为组织工程种子细胞的骨髓间充质干细胞,在体外培养条件下转染bFGF基因对其增殖和分化的影响。③将转染碱性成纤维生长因子基因的人骨髓间充质干细胞与珊瑚骨复合培养,体内外观察转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况。④评价采用珊瑚骨复合入骨髓间充质干细胞构建组织工程下颌髁突骨软骨复合组织的可行性。本研究将为以后进一步探索有效的途径对髁突骨软骨组织缺损进行形态和功能修复,为组织工程组织的临床应用奠定基础。　　 本课题研究内容包括如下五部分:第一部分,人骨髓间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性的研究；第二部分,BMSCs体外定向诱导分化的实验研究；第三部分,骨髓间充质干细胞的bFGF基因转染与鉴定；第四部分,BMSCs与珊瑚骨复合培养细胞生长状况:第五部分,BMSCs与珊瑚骨复合构建下颌髁突的动物实验研究。　　 第一部分人骨髓间充质细胞体外分离培养及其生物学特性　　 目的：探讨人骨髓来源MSCs的分离、培养和鉴定方法,为骨组织工程提供种子细胞。　　 材料和方法：从捐赠者髂骨穿刺收取骨髓细胞,采用密度梯度离心和贴壁培养法进行培养和纯化BMSCs,取生长良好的P3或P4代BMSCs进行检测:①MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析；②流式细胞仪检测BMSCs细胞表面抗原标记和细胞增殖周期；③免疫荧光分析细胞骨架；④细胞染色体核型分析。　　 结果：①利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法分离人BMSCs,经传代后细胞形态呈梭形,成纤维细胞样,均匀一致。②MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析结果显示BMSCs在传代后经历游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期和平台期。③流式细胞仪检测显示所获得的BMSCs表面抗原标记高度一致,纯度高；表面标记阳性率分别为:CD29(99.0％)、CD44(100％)、CD55(97.1％)和CD71(96.7％)；而一些标记阳性率较低,分别为:CD14(1.9％)、CD34(0.8％)、CD45(4.5％)和CD106(7.7％)；BMSCs细胞周期检测结果为G0+G1期91.3％、G2期4.1％和S期4.6％,说明大部分细胞仍处于静止期。⑤微管微丝免疫荧光染色结果显示,培养的BMSCs具有良好的细胞骨架系统。⑥第7代的BMSCs染色体检测结果显示,被测标本有正常染色体数目(2n=46,XY),且未见染色体异常。　　 结论：从人骨髓中能分离出高度一致的BMSCs,这些细胞具有正常细胞骨架结构以及正常的人类染色体数目和形态,可作为骨组织工程的种子细胞。　　 第二部分骨髓间充质干细胞体外多向诱导分化的实验研究　　 目的：探讨人骨髓来源MSCs多向分化能力,为骨组织工程提供种子细胞。　　 材料和方法：取生长良好的P3或P4代BMSCs进行多向诱导分化及相关检测:①成脂肪诱导分化,苏丹黑B、油红O染色检测；②成骨细胞诱导分化,Vonkossa和茜素红染色鉴定；③神经细胞诱导分化,甲苯胺蓝尼氏和GFAP免疫组化染色鉴定。　　 结果：①成脂诱导后细胞胞浆内可见脂滴,苏丹黑B、油红O染色均呈阳性；②成骨诱导后,Von kossa和茜素红染色均呈阳性；③神经元样细胞诱导后,细胞由梭形变为有多个突起的神经元样细胞,甲苯胺蓝尼氏和GFAP免疫组化染色均为阳性。　　 结论：本实验分离培养的人BMSCs能够分化为成脂细胞、成骨细胞和神经元样细胞,这些细胞具有多向分化能力,可作为骨组织工程的种子细胞。　　 第三部分骨髓间充质干细胞的bFGF基因转染与鉴定　　 目的：探讨作为组织工程种子细胞的骨髓间充质干细胞,在体外培养条件下转染bFGF基因对其生物学特性的影响。　　 材料与方法：大肠杆菌DH5α(含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体)及大肠杆菌DH5α(含真核表达载体pcDNA3.1)。将DH-5α菌(含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体)扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒酶切鉴定和测序。选取生长良好的P2或P3代BMSCs,利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到BMSCs,G418筛选获得抗性克隆。采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Western-blot检测转染bFGF的骨髓间充质干细胞bFGF基因及其产物的表达,MTT法检测和流式细胞仪检测细胞的增殖情况和细胞增殖周期。并将转染和非转染BMSCs分别成骨诱导分化,对其碱性磷酸酶活性进行测定。　　 结果：脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染BMSCs,经免疫组化和Western-blot检测,证实转染细胞确实表达bFGF,并且表达部位主要在胞浆。转染细胞增殖活力加强,生长曲线上移,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05)。碱性磷酸酶活性检测结果表明转染细胞的碱性磷酸酶活性高于非转染细胞(P<0.05)。　　 结论：用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF重组真核表达载体成功导入体外培养的BMSCs,bFGF基因改良的BMSCs可以改善其生存状态和促进其增殖。　　 第四部分转染bFGF基因的BMSCs在珊瑚骨表面生长状况　　 目的：将转染碱性成纤维生长因子基因的人骨髓间充质干细胞与珊瑚骨复合培养,体内外观察转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况。　　 材料和方法：珊瑚人工骨:选用海南省浅海滩产石头状滨珊瑚为原料,将其制成12 mm×8 mm×5 mm的下颌髁突状。菌株:大肠杆菌DH5α(含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体)及大肠杆菌DH5α(含真核表达载体pcDNA3.1)。选取生长良好的转染碱性成纤维生长因子基因骨髓间充质干细胞和未转染的骨髓间充质干细胞各300μl(浓度为4×107细胞/ml)细胞悬液,分别接种于不同珊瑚表面。采用MTT法观察细胞.支架联合培养骨髓间充质干细胞的增殖情况和利用扫描电镜观察珊瑚支架上细胞的生长状况。　　 结果：MTT法检测显示细胞.支架联合培养转染组细胞与联合培养未转染组细胞增殖相比差异有统计学意义(P<0.05),联合培养转染组细胞生长增殖强于未转染组细胞。而联合培养的未转染组细胞同单纯培养未转染组细胞增殖相比差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察显示体外培养和植入体内的转染组细胞和未转染组骨髓间充质干细胞均贴附在珊瑚上,并在材料上完全铺展,形态多样,随着培养时间的延长,细胞向孔内长入或跨越微孔连成网状或片状,呈多层生长并且分泌细胞外基质覆盖于细胞表面。　　 结论：转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况较未转染组好,珊瑚人工骨不影响骨髓间充质干细胞的增殖,可以作为骨髓间充质干细胞支架材料构建组织工程骨。　　 第五部分 BMSCs与珊瑚骨复合构建下颌髁突动物实验研究　　 目的：评价采用珊瑚骨复合人骨髓间充质干细胞构建组织工程下颌髁突骨软骨复合组织的可行性。　　 材料和方法：以多孔的珊瑚骨为材料预制人下颌髁突模型,体外培养扩增人骨髓间充质干细胞,并通过脂质体法将bFGF基因转染到骨髓间充质干细胞,分别诱导分化为成骨和软骨细胞。实验分4组,每组6只:第1组,珊瑚骨表面接种300μl浓度为4×107细胞/ml转染bFGF基因成骨诱导的骨髓间充质干细胞悬液；第2组,在珊瑚骨表面接种300μl浓度为4×107细胞/ml转染bFGF基因成骨诱导的BMSCs悬液,然后包被含8×106软骨细胞(浓度为4×107细胞/ml200μl)的透明质酸凝胶；第3组,珊瑚骨表面接种300μl浓度为4×107细胞/ml骨髓间充质干细胞细胞悬液；第4组,植入单纯珊瑚骨支架。体外孵育2天后植入裸鼠背部皮下,6、9和12周后取材,作大体、X线、组织学和免疫组化观察。　　 结果：大体和X线观察髁突形珊瑚骨支架均基本维持最初的形态。组织学观察,第1组可见成片的新生骨,新生骨明显多于第3组,在骨岛周围可见增生的血管。第2组形态结构与原植入模型支架相似,组织学观察有骨和软骨组织结构,骨组织内有新生骨板,并可见软骨内成骨现象,骨与软骨排列无序,在骨组织周围可见较多增生的血管,未见正常髁突骨软骨结构。免疫组化染色显示第1和第2组新生骨有Ⅰ型胶原和bFGF表达,软骨有Ⅱ型胶原和bFGF表达。第3组仅可见散在的的骨岛,未见软骨形成。第4组未见骨和软骨形成。　　 结论：利用单一来源转染bFGF基因的BMSCs分别诱导为成骨和成软骨细胞,利用珊瑚骨支架和包被透明质酸凝胶,可以在裸鼠体内构建具有骨和软骨复合结构的人形下颌髁突,为将来临床修复髁突骨软骨缺损提供实验基础和理论依据。