第一部分促肾上腺皮质激素受体mRNA在肾上腺肿瘤中的表达目的:促肾上腺皮质激素(ACTH)通过其受体(ACTH-R)对肾上腺皮质的增生、分化以及激素合成等发挥着重要的作用。随着影像学的普及,肾上腺意外瘤的检出率明显增加,探讨肾上腺皮质肿瘤的发病机制对诊断和治疗有重要的意义。肾上腺皮质癌中ACTH-R基因的杂合缺失增加,并伴有癌组织中ACTH-RmRNA表达降低,提示ACTH-R基因可能是抑癌基因。本研究拟检测ACTH-RmRNA在肾上腺皮质肿瘤、嗜铬细胞瘤以及正常肾上腺皮、髓质中的表达,初步探讨ACTH-R与肾上腺肿瘤的关系。方法:用TRIZOL分别提取6例正常人肾上腺皮质和髓质、2例特发性醛固酮增多症肾上腺组织、24例肾上腺皮质腺瘤(库欣综合征10例,原醛症14例)和20例嗜铬细胞瘤组织的总RNA;RT-PCR方法检测不同组织中ACTH-R和内参GAPDH mRNA的表达;计算目的条带和内参照条带的灰度比值,对ACTH-RmRNA的表达进行半定量分析,比较不同组织中ACTH-R mRNA表达的差异,分析ACTH-R mRNA表达和肿瘤大小、血浆醛固酮水平等生化指标的关系。结果:1.正常肾上腺皮质中ACTH-R/GAPDH mRNA灰度比值为0.67±0.22;而醛固酮分泌瘤中ACTH-R/GAPDH mRNA灰度比值为1.76±0.46,明显高于正常肾上腺皮质(p＜0.01);皮质醇分泌瘤中ACTH-R/GAPDHmRNA灰度比值为0.27±0.09,明显低于正常肾上腺皮质(p=0.01)。2.醛固酮分泌瘤中ACTH-R mRNA表达(1.76±0.46)明显高于皮质醇分泌瘤(0.27+0.09,p＜0.01)。3.醛固酮分泌瘤中ACTH-R mRNA表达与立位刺激后血浆醛固酮水平的变化呈负相关(r=-0.712,p=0.002),而和肿瘤大小、卧位血浆醛固酮水平无明显相关(p＞0.05)。4.正常肾上腺髓质中ACTH-R/GAPDH mRNA灰度比值为0.23±0.05,明显低于正常肾上腺皮质(p=0.006),而嗜铬细胞瘤组织中未见有ACTH-R mRNA的表达。结论:1.醛固酮分泌瘤组织中ACTH-R mRNA表达可能影响APA患者对血管紧张素Ⅱ的反应,提示ACTH可能在部分APA的发生中起到一定作用。2.ACTH及其受体与嗜铬细胞瘤的发生可能无关。第二部分肾上腺肿瘤中促肾上腺皮质激素受体的蛋白表达目的:第一部分研究从mRNA水平显示醛固酮分泌瘤中ACTH-R表达增加,但这一结果并未被所有研究证实。因此本研究拟观察。肾上腺皮质激素受体(ACTH-R),即褪黑素受体2(MC2-R)在肾上腺皮质肿瘤、嗜铬细胞瘤以及正常肾上腺皮、髓质中的蛋白表达,进一步从蛋白水平探讨ACTH受体与肾上腺肿瘤特别是醛固酮分泌瘤的关系。方法:分别提取6例正常人肾上腺皮质和髓质、2例特发性醛固酮增多症肾上腺组织、24例肾上腺皮质腺瘤(库欣综合征10例,原醛症14例)和10例嗜铬细胞瘤的组织总蛋白,并测定蛋白浓度。Western blot方法检测不同组织中ACTH受体和内参β-actin的表达;分析目的条带和内参照条带的灰度比值,对ACTH受体蛋白的表达进行半定量分析,比较不同组织中ACTH-R蛋白表达的差异。结果:1.正常肾上腺皮质中ACTH-R/β-actin为0.80±0.37;而醛固酮分泌瘤中ACTH-R/β-actin为1.09±0.09,明显高于正常肾上腺皮质(p＜0.001)。皮质醇分泌瘤中ACTH-R/β-actin为0.47±0.09,明显低于正常肾上腺皮质(p=0.002)。2.醛固酮分泌瘤中ACTH-R蛋白表达明显高于皮质醇分泌瘤(p＜0.001)。3.醛固酮分泌瘤中ACTH-R蛋白表达与立位刺激后血浆醛固酮的变化呈负相关(r-0.733,p=0.003),而和肿瘤大小、卧位血浆醛固酮水平未见明显相关关系(p＞0.05)。4正常肾上腺髓质和嗜铬细胞瘤中未见有ACTH-R蛋白表达。结论:1.与mRNA结果一致,从蛋白水平也证实醛固酮分泌瘤组织中ACTH-R表达可能影响APA患者对血管紧张素Ⅱ的反应,提示ACTH可能在醛固酮分泌瘤特别是血管紧张素Ⅱ无反应的醛固酮分泌瘤的发生中起到一定作用。2.从蛋白水平也显示ACTH及其受体可能和肾上腺髓质的生理和病理过程无关。第三部分ACTH-R基因与肾上腺皮质肿瘤目的:肾上腺皮质肿瘤的发病机制仍不清楚,遗传因素可能起了重要作用。ACTH-R基因启动子区的多态性影响肾上腺皮质雄激素和皮质醇的合成,醛固酮分泌瘤中ACTH-R高表达、皮质醇分泌瘤中ACTH-R低表达是否和ACTH-R基因相关尚未阐明。因此本研究拟检测伴或不伴家族史的肾上腺皮质肿瘤和增生患者中ACTH-R基因编码区和启动子区中基因突变的频率及类型,探讨ACTH-R基因的遗传学改变在肾上腺皮质肿瘤发生中的意义。方法:1、收集北京协和医院内分泌科2005年至2006年10月期间确诊的原发性醛固酮增多症患者78例(其中特发性醛固酮增多症32例,醛固酮分泌瘤46例)、皮质醇分泌瘤16例和52例年龄匹配的健康人外周血并提取基因组DNA;采集2003年至2006年10月期间在我院接受手术的APA患者组织标本29份提取基因组DNA。2、收集有。肾上腺皮质腺瘤家族史的2个家系和1个Addison氏病的家系部分亲属的16份血标本进行ACTH-R基因突变检测。3、PCR扩增ACTH-R基因的编码区和启动子区,对PCR产物直接测序以分析可能的基因突变和多态位点。4、所有研究对象各SNP位点的Hardy-Weinberg平衡检验、连锁不平衡程度检验和单倍体型分析采用SHEsis软件进行。结果:1.2例特发性醛固酮增多症患者外周血(2/32)和4例APA患者外周血(4/46)中ACTH-R基因非编码区不同位点发生基因突变,其中启动子区-41bp和—347bp位点的基因突变在APA中的发生率为8.7%(4/46)。2.中ACTH-R启动子区和靠近编码区3’端的非编码区检测到7个SNP位点,其中启动子区—58bp C＞T为新发现的SNP位点,正常人群中T等位基因的频率为8%,C等位基因频率为92%;CC基因型频率为85%,CT基因型频率为15%,未检测到TT基因型。3.启动子区—759bp位点A等位基因(rs1893220)和—2bp位点C等位基因在皮质醇分泌瘤患者中的频率明显高于醛固酮分泌瘤患者(p＜0.05)。4、对不完全连锁的几个SNP位点(rs4797824,rs1893219,和启动子区—2bp)进行单倍体型分析,结果显示单倍体型分布在正常人外周血和APA瘤组织间的差异有显著性,ATT(15%vs 1%,p＜0.01)和GCT(9%vs 1%,p=0.01)单倍体在醛固酮分泌瘤组织中有更高的频率。5、醛固酮分泌瘤患者中ACTH-R基因非编码区的SNP位点和血浆醛固酮水平相关,AA基因型(rs4797825)和AG+AA基因型(rs4797824)具有较高的血浆醛固酮水平(p≤0.05)结论:1.醛固酮分泌瘤中ACTH-R基因启动子区基因突变的频率增加。2.ACTH-R基因启动子区的调控异常可能参与了醛固酮分泌瘤的发生。