研究背景多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类重要的环境污染物,能通过呼吸、饮食、饮水和皮肤等多种途径进入人体。PAHs分布广泛,多种PAHs化学物并具有致癌性和致突变性,被国际癌症研究中心(IARC)划分为很可能的人类致癌物。此外,研究发现PAHs及其活性中间产物也能影响雄性生殖功能,最终导致不育。动物实验和人群流行病学研究均报道PAHs暴露水平升高与精液质量下降和精子DNA损伤相关,增加男性不育的风险。然而,PAHs对男性生殖能力的潜在影响仍然存在不确定性,尤其是在普通人群低剂量接触暴露中,PAHs暴露与雄性生殖损伤之间的弱效应,可能仅用常规的精液质量难以衡量,而需要寻找环境PAHs低暴露条件下致雄性生殖损伤的更敏感的生物标志物。此外,PAHs诱发雄性生殖毒性的分子事件及其潜在的机制仍不清楚。因此,对遗传损伤的分子机制进行溯源,发现PAHs造成生殖细胞损害的分子靶点,将为探索反映PAHs雄性生殖损害的生物标志物提供重要的依据。端粒和线粒体DNA在维持基因组完整性和细胞正常生理功能中起重要作用。既往的研究表明,PAHs能诱导细胞端粒DNA和线粒体损伤,提示端粒和线粒体结构和功能的异常可能是PAHs造成雄性生殖损害的重要靶点。本研究中,以本课题组开展的大学生生殖健康队列研究(MARHCS)为基础,分析PAHs环境暴露与精子端粒DNA和线粒体DNA损伤的关联。进一步选择PAHs的典型代表物B[a]P及其代谢产物BPDE开展体外和体内实验,探讨其对雄性生殖细胞端粒和线粒体结构和功能的损伤效应及其在雄性生殖损害中的作用及机制。研究内容1.重庆市大学生人群PAHs暴露与精子遗传损伤和精液质量的关联研究以本课题组在2013-2015年开展的MARHCS队列研究为基础,采用2014年第一次随访的人群(n=666)生物样本(尿液和精液)进行PAHs内暴露水平和精子多项损伤指标的评价。采用GC-MS检测尿液中PAHs代谢产物水平,荧光定量PCR检测精子端粒长度和精子mtDNAcn,JC-1检测精子线粒体膜电位,Long-PCR检测mt DNA完整性,Annexin V-FITC检测精子凋亡以及常规精液质量指标。在此基础上,分析了PAHs尿代谢产物与上述精子损伤相关指标的关联。通过人群研究探讨PAHs环境暴露致男性生殖损伤的生物标志物。2.BPDE和B[a]P诱导生精细胞衰老和凋亡过程中端粒损伤机制研究建立了BPDE染毒的小鼠精母细胞株GC-2模型。采用台盼蓝染色法检测细胞存活率,Annexin V/PI结合流式细胞仪分析检测细胞凋亡,SA-β-Gal染色的方法检测细胞衰老,用于评价BPDE对GC-2细胞的毒性效应;进一步采用荧光定量PCR和末端限制片段长度分析(TRF)的方法检测细胞端粒长度,FISH结合γ-H2AX免疫荧光方法检测端粒DNA断裂,TRAP-PCR-ELISA检测端粒酶活性以及Western blot检测端粒酶逆转录酶(TERT)的蛋白表达水平,用于评价BPDE对GC-2细胞的端粒损伤效应。另外,采用Western blot检测DNA损伤反应通路相关蛋白的表达,观察BPDE对GC-2细胞内DNA损伤反应的激活情况。在此基础上,采用sh RNA-TERT和p LV-EGFP-TERT载体构建了TERT干扰和再表达的GC-2转染细胞模型,研究TERT基因在BPDE诱导的细胞衰老和凋亡中的作用。在细胞实验结果基础上,我们建立了B[a]P(0、5、10和20 mg/kg)灌胃染毒SD大鼠7天动物模型,进一步验证体外GC-2细胞实验的结果。3.BPDE诱导生精细胞凋亡过程中线粒体损伤机制研究建立了BPDE染毒的GC-2细胞模型。采用NAO染色方法检测线粒体质量、RT-PCR检测mtDNAcn的改变、JC-1检测线粒体膜电位的变化、Western blot检测线粒体呼吸链关键蛋白COX IV、转录共激活因子PGC-1α以及线粒体凋亡通路相关蛋白,如Cyt C、caspase-9、caspase-3的表达水平,以评价BPDE对生精细胞的线粒体功能、线粒体生物合成和线粒体途径凋亡的影响。在此基础上,采用PGC-1α激活剂ZLN005预处理GC-2细胞后,检测BPDE对上述线粒体损伤相关指标的影响,以明确PGC-1α在BPDE诱导的生精细胞线粒体损伤和细胞凋亡中的作用。此外,利用上述构建的TERT干扰和再表达转染细胞,进一步研究BPDE诱导的生精细胞线粒体损伤效应,探讨端粒调控与线粒体损伤之间的联系,以明确TERT在BPDE诱导的生精细胞线粒体损伤中的作用。研究结果1.人群PAHs暴露与精子端粒长度和精子线粒体拷贝数的相关性本研究共检测了8种PAHs尿代谢产物,包括1-OHNap、2-OHNap、1-OHPhe、2-OHPhe、3-OHPhe、4-OHPhe、2-OHFlu和1-OHPyr。研究结果显示,尿中1-OHPyr和1-OHNap与精子端粒长度呈负相关,1-OHPyr(β=-0.385;95%可信区间[CI]:-0.749~-0.021;1-OHNap(-0.079;95%CI:-0.146~-0.011)。尿中2-OHPhe、3-OHPhe、∑Phe metabolites和2-OHFlu水平与精子mtDNAcn呈负相关,2-OHPhe(-9.427;95%CI:-17.586~-0.459);3-OHPhe(-11.488;95%CI:-19.462~-2.725);∑Phe metabolites(-9.635;95%CI:-17.965~-0.688);2-OHFlu(-11.692;95%CI:-19.647~-2.949)。尿中PAHs代谢物与精子线粒体膜电位和mt DNA完整性之间没有统计学上显著关联。此外,未观察到这8种PAHs尿代谢产物与精子凋亡和常规精液质量指标(包括精液量、精液密度、精子总数和精子前向运动百分率)之间的相关性。上述结果提示,低水平PAHs暴露可能造成精子端粒和线粒体损伤,并且精子端粒长度和精子mtDNAcn改变可能作为低剂量PAHs环境暴露致男性生殖损伤的敏感指标。2.BPDE和B[a]P诱导生精细胞衰老和凋亡过程中端粒损伤机制研究BPDE对GC-2细胞具有显著的毒性效应,能引起生精细胞增殖抑制、衰老和凋亡。进一步研究发现,BPDE处理能诱导GC-2细胞端粒损伤,包括端粒长度缩短,端粒DNA断裂,以及DNA损伤反应通路(ATM/Chk1/p53/p21)的激活。端粒酶是调节雄性生殖细胞端粒长度的重要因素,研究结果显示BPDE处理可引起细胞端粒酶活性以及端粒酶活性限速因子TERT的蛋白表达水平的降低,提示端粒结构和功能异常是BPDE诱导雄性生殖细胞损伤的靶点。此外,采用建立的TERT转染细胞模型发现,干扰TERT的表达,可加重BPDE诱导的端粒损伤、细胞衰老、细胞凋亡以及DNA损伤反应通路的激活,恢复TERT的表达则部分对抗了BPDE的损伤效应。这些结果提示TERT参与介导了BPDE诱导的端粒DNA损伤相关的生精细胞衰老和凋亡。此外,体内动物实验结果显示B[a]P染毒可引起大鼠生精细胞端粒缩短,TERT蛋白表达水平降低以及DNA损伤反应的激活,并诱发睾丸毒性,包括生精细胞凋亡和衰老,睾丸组织结构改变等,这些结果进一步验证了细胞实验结果。3.BPDE诱导生精细胞凋亡过程中线粒体损伤机制研究BPDE处理引起GC-2细胞线粒体质量降低,mtDNAcn下降,线粒体膜电位降低,线粒体生物合成和氧化磷酸化相关蛋白COX IV和PGC-1α的表达水平降低,线粒体凋亡途径相关蛋白Cyt C、caspase-9和caspase-3的表达升高,表明BPDE可导致线粒体功能损伤和生物合成障碍。GC-2细胞预处理PGC-1α激活剂ZLN005后降低了BPDE诱导的线粒体损伤和细胞凋亡,提示PGC-1α参与调控BPDE诱导的线粒体损伤相关的生精细胞凋亡。此外,进一步分析BPDE诱导的端粒与线粒体损伤的联系,采用TERT转染细胞模型研究显示:TERT抑制可加重BPDE诱导的线粒体损伤,包括线粒体质量、mtDNAcn、线粒体膜电位以及线粒体凋亡途径相关蛋白的表达.;相反,恢复TERT表达则部分对抗了BPDE对线粒体损伤效应,提示TERT通过调控PGC-1α的表达,参与调控BPDE诱导的线粒体损伤。研究结论流行病学研究显示,重庆市大学生人群中PAHs内暴露水平与精子端粒长度缩短和精子mtDNAcn降低存在显著的关联,提示精子端粒DNA和线粒体DNA可能是PAHs化学物造成男性生殖损伤的敏感靶点。小鼠精母细胞GC-2和大鼠染毒实验进一步证实,PAHs的典型代表物B[a]P及其活性代谢产物BPDE可诱导生精细胞的端粒和线粒体结构及功能异常,最终导致细胞的衰老和凋亡等生殖毒性。这一过程中,BPDE可抑制TERT表达,通过端粒损伤及DNA损伤反应途径造成生殖毒性;另一方面BPDE可抑制PGC-1α表达,通过线粒体损伤和凋亡途径造成生殖毒性。其中TERT基因在这两条途径中起关键调控作用。