【摘 要】
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哺乳动物细胞内非受体酪氨酸激酶c-Abl在正常生理及病理条件下具有多种生物学功能,参与细胞增殖、细胞粘附、细胞凋亡、应激反应、细胞转化等过程的调控。前期研究以全长c-Abl为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统筛选Hela细胞cDNA文库,获得一系列与c-Abl存在相互作用的蛋白,发现HAX-1有可能与c-Abl相互作用。HAX-1具有强的抗细胞凋亡作用,与细胞存活有关,并参与细胞运动及迁移,在功能上与c
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哺乳动物细胞内非受体酪氨酸激酶c-Abl在正常生理及病理条件下具有多种生物学功能,参与细胞增殖、细胞粘附、细胞凋亡、应激反应、细胞转化等过程的调控。前期研究以全长c-Abl为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统筛选Hela细胞cDNA文库,获得一系列与c-Abl存在相互作用的蛋白,发现HAX-1有可能与c-Abl相互作用。HAX-1具有强的抗细胞凋亡作用,与细胞存活有关,并参与细胞运动及迁移,在功能上与c-Abl有一定的相关性,但对其功能调节的机理仍不清楚。本研究试图通过对二者的相互作用及在生物学功能方面的联系,为进一步阐明HAX-1与c-Abl在细胞凋亡及氧化应激反应发生发展的机制提供线索。本研究利用免疫共沉淀、免疫印迹、GST pulldown等方法证实HAX-1与c-Abl在细胞内外存在相互作用,c-Abl通过其SH3结构域与HAX-1 C末端150-176位氨基酸残基区域结合。通过抗酪氨酸磷酸化抗体的免疫印迹检测证实HAX-1促进c-Abl蛋白的酪氨酸磷酸化水平从而激活c-Abl的酪氨酸激酶活性。研究发现,HAX-1能够剂量依赖方式导致细胞内c-Abl蛋白水平下降,这种调节机制是不依赖于c-Abl蛋白的激酶活性,与HAX-1通过C端与c-Abl相互作用一致,HAX-1通过其C末端结构域调控c-Abl的表达。利用siRNA将HAX-1基因沉默,得到HAX-1敲低的细胞株MCF-7/HAX-1siRNA,发现该细胞中c-Abl蛋白水平增加,从而进一步证实HAX-1对c-Abl蛋白水平的调控作用。通过RT-PCR证实HAX-1不是在mRNA水平上对c-Abl蛋白表达进行调控;放线菌酮阻抑实验及Pulse-chase实验证实,在HAX-1过表达时,c-Abl的半衰期为3.31h,低于c-Abl在正常细胞中的半衰期（6.17h）,说明HAX-1主要通过促进c-Abl降解来调控细胞内c-Abl的蛋白质水平。通过蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,检测在有或无HAX-1存在条件下c-Abl蛋白表达变化量的差异,证实了HAX-1可以促进c-Abl通过蛋白酶体途径降解,最终导致细胞质及细胞核内的c-Abl蛋白水平下降。由于c-Abl通过P73参与细胞内凋亡作用。为研究HAX-1调节c-Abl蛋白水平的凋亡效应,应用凋亡诱导剂顺铂、IR,分别处理MCF-7/HAX-1siRNA及MCF-7（WT）细胞,流式细胞仪检测分析细胞凋亡率,发现在4mM顺铂处理12h,或者5GyIR处理后,MCF-7/HAX-1siRNA细胞表现较高的细胞凋亡;应用c-Abl激酶抑制剂STI571处理后,MCF-7/HAX-1siRNA细胞的凋亡率降低,提示HAX-1通过调节c-Abl蛋白水平参与细胞凋亡。由于ROS能够激活细胞质中c-Abl激酶活性,引起氧化应激反应,诱导细胞发生凋亡。本研究分别通过MTT细胞增殖实验、FACS检测了在H2O2诱导条件下,HAX-1与c-Abl蛋白在细胞增殖及凋亡中的功能及作用,发现HAX-1能够通过改变细胞内c-Abl激酶蛋白水平来抵抗H2O2诱导的细胞凋亡,使细胞能够耐受较高浓度的H2O2处理。通过DCFH-DA、Rhodamine 123等方法检测细胞内ROS水平及线粒体膜电位,证实HAX-1通过调控c-Abl的激酶活性及蛋白水平,参与细胞内ROS水平及线粒体膜电位的调节。应用GPx抑制剂BSO处理MCF-7/HAX-1siRNA及MCF-7（WT）细胞,表明GPx是受调控的直接参与ROS调控的主要蛋白质。本研究发现HAX-1与c-Abl激酶相互作用,增强c-Abl自身磷酸化水平,导致c-Abl激活,并促进c-Abl通过蛋白酶体途径降解,从而参与c-Abl调控的细胞凋亡及氧化应激反应。该研究对于深入认识HAX-1功能及c-Abl非受体酪氨酸激酶的调控机制具有重要的理论意义。
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