烟草(Nicotiana tobacum)NtRab5b是一个植物特异性的小GTP结合蛋白，本论文对其亚细胞定位及其功能进行了研究。首先，本研究在原核中表达了NtRab5的GST融合蛋白GST-NtRab5b。通过对GST-NtRab5b的测定证实了NtRab5b的GTP结合活性。为了进一步的定位和功能研究，本研究利用去除GST标签的重组NtRab5b作为抗原制备了NtRab5b特异性的抗体。　　 接着对NtRab5b在细胞中的定位及第二位甘氨酸在定位中的作用进行了分析研究。因为预测其氨基端对定位有重要作用，所以将NtRab5b的羧基端与报告基因GFP融合构建了NtRab5b-GFP植物表达载体，并转化了烟草BY-2细胞。NtRab5b-GFP在转基因细胞中大部分呈点状结构。利用药物(wortmannin和brefeldin A)处理，根据NtRab5b-GFP标记结构的变化初步判断NtRab5b-GFP主要定位在前液泡区(prevacuolar compartment，PVC)。又进一步通过与前液泡区标记物VSRat-1共定位实验及免疫电镜实验证实了NtRab5b的前液泡区定位。与这些结果一致的是，瞬时共表达实验中NtRab5b-GFP还与也被定位在前液泡区的拟南芥同源蛋白Ara6和Rhal共定位；NtRab5b-GFP也与内吞示踪染料FM4-64共定位。点突变体NtRab5b(G2A)-GFP弥散分布于细胞质和细胞核中，NtRab5b氨基端40个氨基酸与GFP的融合蛋白NtRab5bN-GFP大部分定位在细胞膜上，因此证明了NtRab5b氨基端的第二位甘氨酸是其正确定位于前液泡区的必要而非充分条件。　　 然后对NtRab5b在植物中的表达模式及转基因植物的表型进行了分析。Western blot分析表明NtRab5b在所检测的组织的根、茎、叶中普遍表达，没有组织特异性；幼苗和成熟植株中的表达也没有差异。有趣的是，盐胁迫早期时NtRab5b的RNA和蛋白表达水平都表现为上调。通过分析盐胁迫下NtRab5b、NtRab5b(G2A)超量表达和NtRab5b沉默的转基因烟草的表型，发现NtRab5b超量表达烟草的主根比野生型的长，而NtRab5b(G2A)超量表达烟草的主根比野生型的短，这表明NtRab5b可能通过前液泡区介导的内吞途径参与烟草幼苗对盐胁迫的反应。　　 水稻OsRab5b是本实验室克隆的另一个植物特异性的Rab5b类。为了比较不同植物的Rab5b的定位，本论文也研究了OsRab5b在细胞中的定位及第二位甘氨酸在定位中的作用进行了分析研究，其思路和结果都和NtRab5b的相似。NtRab5b-GFP在转基因细胞中大部分呈点状结构。利用药物(wortmannin和brefeldin A)处理，根据OsRab5b-GFP标记结构的变化初步判断NtRab5b-GFP主要定位在前液泡区(prevacuolar compartment，PVC)。又进一步通过与前液泡区标记物VSRat-1共定位实验证实了OsRab5b的前液泡区定位。与这个结果一致的是，OsRab5b-GFP也与内吞示踪染料FM4-64共定位。点突变体OsRab5b(G2A)-GFP弥散分布于细胞质和细胞核中，因此证明了OsRab5b氨基端的第二位甘氨酸是其正确定位所必需的。